HSP70在兔動脈粥樣硬化斑塊表達的意義

[摘要] 目的 研究HSP70在兔動脈易損斑塊中表達的意義。方法 建立兔動脈粥樣硬化易損斑塊模型，采用免疫組化技術檢測斑塊不同部位的HSP70表達情況。結果 兔動脈易損斑塊中，熱休克蛋白HSP70在纖維帽區(qū)平滑肌細胞表現(xiàn)為高表達，與肩部區(qū)、脂核區(qū)、中膜平滑肌區(qū)均有顯著性差異：炎細胞在纖維帽區(qū)和肩部區(qū)HSP70表現(xiàn)為高表達，與其余兩區(qū)有顯著性差異。結論 HSP70參與了動脈粥樣硬化斑塊形成過程的免疫應答，激活炎癥細胞，降低了動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性。

[關鍵詞] HSP70；動脈粥樣硬化斑塊

[中圖分類號] R543.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2011）31-05-02

The Significance of HSP70 Expressed in Rabbit Atherosclerotic Plaques

MENG Fanjie TONG Wenzhen FENG Xiangfei

The Centralab of Yidu Central Hospital of Weifang City， Shangdong Province， Qingzhou 262500， China

[Abstract] Objective To study the meaning of HSP70 expressed in rabbit arteries vulnerable plaque. Methods Atherosclerotic rabbit model of vulnerable plaque was established，and plaques in different parts of the expression of HSP70 were detected using immunohistochemical. Results In vulnerable plaque in the arteries rabbits，HSP70 in the fibrous cap region showed high expression of smooth muscle cells. It had the significance difference with the shoulder area，the fat nuclear area and the tunica media vasorum smooth muscle area；Inflammatory cells in the fibrous cap area and the shoulder region showed high expression of HSP70，it had significant differences with the other two areas. Conclusion HSP70 involved in immune response of atherosclerotic plaque formation process，can active inflammatory cells，reduce atherosclerotic plaque stability.

[Key words] HSP70；Atherosclerotic plaques

動脈粥樣硬化是慢性炎癥和免疫反應的交互過程[1]。在這一過程中，熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）作為應邀蛋白參與其中。我們通過動物實驗建立易損斑塊模型，以研究熱休克蛋白在易損斑塊中的作用，探討其作用機制，為動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定尋求治療途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 由青島大學醫(yī)學院實驗動物中心提供健康新西蘭純種大白兔30只，體重1.5～3.0kg，月齡（3.7±1.5）個月，雌雄不限。高脂飲食4個月，分籠按清潔級動物飼養(yǎng)，飲用純凈水，24h通風，室溫（23±2）℃。

1.1.2 試劑與藥品 抗HSP70單克隆抗體和免疫組化檢測試劑盒由上海復興高科技有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 兔動脈粥樣硬化斑塊模型的制作 在30只兔子高脂飲食1周后，行腹主動脈內(nèi)膜損傷術，方法如下：用速眠新（0.2～0.3）mL/kg將大白兔肌肉注射麻醉后，右下肢腹股溝和股部備皮，切開皮膚并暴露股動脈至髂外動脈處，上下兩端夾以血管夾，切開髂外動脈或股動脈近端約2～3mm，插入3F的Fogarty球囊導管，向心臟方向插入20cm至升主動脈根部，向球囊內(nèi)充注0.1～0.2mL生理鹽水擴張球囊（維持球囊內(nèi)壓力在2個大氣壓左右），拉回至髂外動脈處。共反復3次。然后用9/0絲線縫合血管，關閉傷口。術中若血管痙攣，可用利多卡因浸泡血管數(shù)分鐘。若蘇醒，可靜脈推注鹽酸氯胺酮（10～20）mg/kg。術后每日肌注慶大霉素8萬單位，連續(xù)3d。

兔子飼養(yǎng)4個月后，采用空氣栓塞處死，取其腹主動脈，生理鹽水沖干凈，取其斑塊明顯處數(shù)段，每段約1cm左右，其中一段浸入4%多聚甲醛中固定12～24h，制備石蠟標本。

1.2.2 檢查方法 ①形態(tài)觀察：在光學顯微鏡下觀察動脈斑塊的形成情況；②組織切片的制備：選取合適的斑塊部位，按以下程序制備切片：固定，包埋，HE染色，然后在顯微鏡下觀察。

1.2.3 觀察結果的分區(qū) 在光學顯微鏡下進行觀察，將切片分為4個區(qū)，依次為：纖維帽區(qū)（斑塊表面），脂核區(qū)（斑塊中部），肩部區(qū)（斑塊與正常血管壁交界處）和中膜平滑肌區(qū)（基底部區(qū)）。進一步對血管標本沿縱軸進行切割，以分區(qū)明顯的部位進行標記，根據(jù)細胞形態(tài)及染色情況來區(qū)分不同的細胞。

1.2.4 HSP檢測 采用免疫組化技術，嚴格按試劑盒的操作說明進行。

1.2.5 計算方法 在400倍顯微鏡下觀察5個視野，采用IPP（Image Pro Plus）4.5圖像分析軟件計算各區(qū)中HSP70表達陽性細胞，計算其百分數(shù)，即陽性率（為該視野陽性細胞數(shù)與細胞總數(shù)的比值），取其均值代表每一樣本數(shù)。

1.2.6 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)以（χ±s）表示，應用SAS9.2統(tǒng)計軟件包分析，各區(qū)間兩兩比較用Nemenyi法秩和檢驗。

2 結果

在正常細胞胞漿中，HSP70的表達呈均勻淡紫色，而在陽性表達的細胞胞漿中，其表達呈深淺不一的棕褐色（圖1）。在易損斑塊的纖維帽區(qū)平滑肌細胞表現(xiàn)為HSP70高表達，與肩部區(qū)、脂核區(qū)、中膜平滑肌區(qū)差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05）。炎細胞在纖維帽區(qū)和肩部區(qū)HSP70表現(xiàn)為高表達，與脂核區(qū)、中膜平滑肌區(qū)差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）。

3 討論

熱休克蛋白（HSP）是一類具有重要生理功能和高度保守的多肽類蛋白質(zhì)分子家族，普遍存在于原核和真核細胞中。因受熱或其它應激因素（如缺血、缺氧、理化有害刺激等）作用后，發(fā)生熱休克反應而產(chǎn)生的一類新的蛋白質(zhì)[2]。其主要生物學功能表現(xiàn)在應激狀態(tài)下保護細胞生命活動必需的蛋白質(zhì)，維持細胞生存在細胞生長、發(fā)育、分化、基因轉(zhuǎn)錄等功能方面發(fā)揮重要作用，參與免疫應答等多種生物學功能，也與病毒感染有關[3]。HSP在正常細胞中的表達處于基礎水平，當機體受到有害因素（如炎癥、紫外線、應急、腫瘤發(fā)生等）刺激時，細胞內(nèi)HSPs合成增加，它能保護機體（或細胞）不受或少受傷害。依據(jù)相對分子量的大小可分多個亞家族，包括HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40、小分子HSP和泛素。現(xiàn)認為主要以HSP60、HSP70家族為主，均為免疫顯性分子，能激活人體血管內(nèi)皮細胞表達。研究發(fā)現(xiàn)在炎癥反應中起核心作用的IL-6[4]，它作為炎癥反應的重要介質(zhì)，能夠作用于血管壁，進而引起VEC損傷，導致動脈硬化的發(fā)生。

在HSP家族中，目前研究最多的且作用最為重要的一員是HSP70。HSP70具有分子伴侶功能、抗細胞凋亡功能、抗氧化等多種生物學功能，能夠參與機體的免疫反應，提高細胞的應激耐受性、促進細胞增殖、參與細胞骨架的形成和修復等。其在機體的應激狀態(tài)，如缺氧、缺血、熱刺激、感染等情況下會大量釋放。

本文中，通過制備兔動物易損斑塊模型的切片，觀察HSP70在不同部位的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)：在纖維帽區(qū)和肩部區(qū)，HSP70表現(xiàn)為高度表達，其中在炎細胞中的表達高于平滑肌細胞，原因可能與不同區(qū)受到的切應力大小不同有關。因為切變力從斑塊表面到基底部逐漸減少，在斑塊表面，其受到的切變力最大，最容易破裂；而在基底部，由于受到的切變力最小，最為穩(wěn)定，因此HSP70表達明顯較纖維帽區(qū)和肩部區(qū)減少。HSP70在平滑肌細胞和炎細胞中的高表達，應與HSP的保護作用和誘發(fā)炎癥功能有關。

[參考文獻]

[1] 張鵬飛，張運，張梅，等. 頸動脈粥樣斑塊應變及應變率分布的初步探討[J]. 中華超聲影像學雜志，2004，13（8）：573-576.

[2] 褚文政，王維. 熱休克蛋白70和缺血性腦損傷[J]. 醫(yī)學綜述，2001，7（12）：759.

[3] 程曉麗，神吉智丈，李春燕，等. 熱休克蛋白10和熱休克蛋白的60表達、純化及與線粒體DNA轉(zhuǎn)錄因子A相互結合[J]． 鄭州大學學報，2007，42（1）：50-52．

[4] Keiko M，Masafumi K，Wu XC，et al．Green tea catechins inhibit the cultured smooth muscle cell invasion through the basement barrier[J]．Atherosclerosis，2003，166（1）：23-30．

（收稿日期：2011-08-23）