六種植物器官提取液對兩種細菌的抑制活性

摘要 以大葉黃楊葉、蒼耳葉、蒼耳莖、蒼耳根、鵝絨掌葉、菝葜葉六種植物器官的提取物作為抑菌劑進行抑茵實驗。六種提取物對供試菌金黃色葡萄球菌和枯草桿菌均有不同程度的抑制作用，其中菝葜葉提取物抑茵作用最大，大葉黃楊葉、蒼耳莖的提取物也具有較強的抑茵作用，可望將其用于食品工業作為防腐劑和抑茵劑。

關鍵詞 植物提取液抑茵作用

中圖分類號Q-33 文獻標識碼B

從植物中尋找天然活性物質已成為食品工業作為防腐劑研制的主要途徑之一。目前，國外對植物源殺菌劑的研究較為深入，如virtanen等發現發芽后5-6d的黑麥實生苗提取物對雪腐鐮孢霉具有抗菌作用；Eberhora等研究表明黃連的提取物對馬鈴薯晚疫苗具有很強的抑制作用。國內也對多種殺菌植物進行了系統研究，成功開發了一些具有市場潛力的新型殺菌劑。如早期對天然大蒜素殺菌活性的研究及結構的確定，成功開發出“抗菌素402”；吳恭謙的研究表明白頭翁的乙醇提取物對小麥赤霉病菌具有較高的抑制作用；林存鑾等人對37科90種植物對番茄花葉病毒(TMV)活性進行篩選研究，發現小藜和玉簪2種植物提取液對TMV病毒有一定的治療作用。從最近的研究看，研究較為深入和成功的當屬從銀杏中分離了多種抗菌活性物質并通過人工模擬合成農用殺菌劑。大量實驗表明，該殺菌劑品種對蘋果炭疽病菌、玉米小斑病菌等多種病害有較為優良的防治效果。

本研究選取了大葉黃楊葉、蒼耳葉、蒼耳莖、蒼耳根、鵝絨掌葉、菝葜葉等六種植物器官的丙酮提取物對2種細菌進行了抑菌活性測定，以獲得有潛力的殺菌植物，為進一步研究開發植物提取物提供素材和佐證。

1.材料和方法

1.1供試材料

菌種：金黃色葡萄球菌和枯草桿菌

供試植物樣品：稱取500 g處理過的植物樣品，移入潔凈干燥的三角瓶中，加入適量丙酮淹沒樣品，加塞，標記，在室溫下連續浸冷三次(時間分別為24h、12 h、6 h)后，用布氏漏斗減壓真空抽濾，合并三次濾液，加入25 mL圓底燒瓶，在旋轉蒸發器上進行減壓濃縮至少量時轉入容量瓶中定容至10 mL，加塞封口備用。

1.2方法

1.2.1制作LB液體培養基

胰蛋白胨10g、酵母提取液5g、氯化鈉10g、蒸餾水1000mL

1.2.1.1培養基各種成分的性質及用途

蛋白胨：蛋白胨是肉類、明膠等蛋白質經過酸或酶的水解產生的，其中主要成分是多肽和氨基酸。蛋白胨是多數微生物很好的氮素營養來源，但注意蛋白胨的成分和來源與制作方法有關。因此實驗所用的蛋白胨不同，結果會有差異。蛋白胨中的色氨酸多半在制作過程中受到破壞，所以有些微生物的培養要在培養基中補充色氨酸。

酵母膏：酵母膏是酵母菌的水溶性自溶物經過濃縮制成，是多種維生素最好的來源，加在培養基中對于有些微生物有刺激生長的作用。酵母膏含有18種氨基酸，含量最高的是谷氨酸，含量較多是天門冬氨酸、丙氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸，酵母膏中碳水化合物的含量達82g/100g，礦物質含量豐富，脂類含量較少。

1.2.2調節培養基的酸堿度

1.2.2.1各種微生物對酸度的適應范圍

微生物只能在一定的酸度范圍內生長。由于真菌對酸的適應范圍廣，并偏好微酸性的反應，所以植物病理實驗中常用的培養基往往是微酸性的，這對一般真菌生長是適宜的，不一定要調節酸度。本實驗中LB培養基需要調到中性。

1.2.2.2培養基酸堿度調節方法

調節培養基PH到中性的方法如下：配成1mol/L的鹽酸和氫氧化鈉，用吸管從配成的1 L的培養基中吸取5 mL放人試管中，加溴百里酚藍指示劑5滴，如培養基呈黃色，則逐滴加入1 mol/L氫氧化鈉；如呈藍色，則逐滴加入1 mol/L鹽酸，使培養基最后呈草綠色。記下所加1 mol/L氫氧化鈉或鹽酸的量，所加的200倍即在1L培養基中應加1 mol/L鹽酸或氫氧化鈉的量。

或者在未調pH前，先用精密pH試紙測量培養基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培養基中逐滴加入1 mol/L NaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測其pH，直至pH達7.6。反之，則用1 mol/L HCl進行調節。注意pH值不要調過頭，以避免回調，否則，將會影響培養基內各離子的濃度。

1.2.3培養基緩沖液的調節

培養基中的緩沖物質可以防止已調好的pH值發生改變。緩沖物質多，則緩沖容也就越大。LB培養液中有蛋白胨，除了提供養分以外，主要還有緩沖的作用，蛋白胨用量大，它的緩沖容也就越大，一般緩沖大的培養基，更適宜微生物的生長。

1.2.4滅菌

1.2.4.1高壓滅菌器的用法和注意事項

(1)檢查滅菌器中存在的水量。加水到指定的標度；

(2)需要滅菌的器物放在滅菌鍋內，將蓋緊密，打開氣門；

(3)加熱，空氣完全排除后關閉氣門；

(4)當壓力上升到需要的指標后，開始計算滅菌時間，滅菌過程中壓力保持不變；

(5)達到需滅菌時間停止加熱，稍微打開氣門排除蒸氣使壓力慢慢減慢；

(6)當壓力降到內外相等時，才能打開高壓滅菌鍋蓋。

1.2.4.2 LB液體培養滅菌

培養基滅菌一般都是加壓蒸氣(121℃ 20min)，蒸氣的壓力和處理的時間可以根據培養基的量和導熱性能增減，如果器皿所盛的量超過1000 mL，則需要延長時間。器皿中所盛培養基的量不能太多，否則滅菌不易完全，同時在滅菌后放氣時，培養基溫度下降要比器皿慢，如果放氣太快，培養基盛得太滿，則會因沸騰而粘濕棉花球。

1.2.5接種

在無菌操作臺內將培養基倒入滅過菌的兩支試管內，每支試管里LB量約為試管的1/4。用接種環將兩個菌種接到LB培養基中。

1.2.6細菌培養

將兩支接種過細菌的試管放入37℃，叵溫箱中培養約12 h。

1.2.7多余培養基的保藏

多余LB培養基不應扔掉，否則造成浪費，應該注明好培養基的種類和配制日期，否則會和實驗室里眾多的培養基發生差錯，第二次使用剩余培養基必須要無菌檢測。

1.2.8活性測定

參照Hiroyuki Haraguchi的方法，稍作修改，方法如下：12 h后在無菌操作臺內分別取45 μL菌液，855 μL LB，60 μL提取物樣品，放人eppendorf試管，繼續放入37℃，恒溫箱中培養140 min。

1.2.9吸光度的檢測

將每個樣品分別放入比色皿中，再用分光光度計檢測樣品在600 nm波長下的吸光度值(A)。

2.試驗結果

在600 nm波長條件下，測定樣品的吸光度，結果如表1。

3.分析討論

3.1 對植物樣品中有效成分的提取

一般有水浸法和有機溶劑萃取法，本實驗選用丙酮作為提取溶劑，其原因如下：丙酮極性適中，對植物樣品中非極性成分與極性成分均能提出；沸點相對低，易揮發，利于濃縮、定容；丙酮本身對病原菌抑制作用較低，更能真實反映提取物的抑菌作用。

3.2 六種植物提取液對兩種細菌的抑制作用比較

培養基中添加抑菌物時，六種植物提取液對2種細菌均有不同程度的抑制作用，細菌從外觀上看表現為生長緩慢，菌數下降，在生理指標上也有了較大的變化。從表1中可以看出，各種提取液的吸光度存在較大的差異，提取液抑菌作用越小，則溶液中細菌繁殖越多，溶液吸光度越大。如果提取物抑菌作用越大，則溶液中細菌越少，溶液吸光度越小。Hiroyuki等人的研究認為吸光度小于0.03時，植物提取液活性很強，具有很強的抑菌效果；吸光度在0.03與0.1之間時，植物提取液活性較強，具有較強的抑菌效果；吸光度在0.1與0.5之間時，植物提取液的活性較弱，具有較弱的抑菌效果；吸光度大于0.5時提取液對細菌沒有抑制作用。參照其標準可認為，本研究中菝葜葉提取液對金黃色葡萄球菌具有很強的抑制作用；蒼耳根提取液對枯草桿菌和蒼耳莖提取液、大葉黃楊葉提取液對金黃色葡萄球菌都具有較強的抑制作用；鵝絨掌葉提取液、蒼耳莖提取液、大葉黃楊葉提取液、蒼耳葉提取液、菝葜葉提取液對枯草桿菌和蒼耳根提取液、鵝絨掌葉提取液、蒼耳葉提取液對金黃色葡萄球菌都具有較弱的抑制作用；丙酮對兩種菌均沒有抑制作用。

不同植物、同一植物的不同器官的丙酮提取液對細菌的抑制效果是不同的。菝葜葉提取液對金黃色葡萄球菌抑制力最強，細菌生長差，這可能是菝葜葉提取液更易向細胞滲透，易于和膜蛋白相互結合，破壞蛋白質空間結構完整性，導致細菌細胞膜的生理功能發生紊亂，因而受到影響。其次蒼耳葉提取液、蒼耳根提取液也具有較強的抑菌作用，且這些植物分布廣泛，資源豐富，值得進一步研究開發。