應用PCR技術快速檢測口腔念珠菌菌株

[摘要]目的：本研究將PCR技術應用于口腔念珠菌檢測中，尋找出一種能夠快速、準確、有效檢測口腔念珠菌的方法。方法：收集口腔臨床唾液樣本100例，科瑪嘉顯色培養基進行培養，同時應用PCR方法對100例臨床樣本進行檢測鑒定。結果：傳統念珠菌培養方法的檢出率為35%；應用兩對引物，PCR方法的檢出率分別為68%和49%。傳統的念珠菌檢測方法耗時長，特別是培養法，需時48hrs；應用PCR方法對念珠菌進行檢測，只需要5hrs，且陽性檢出率和準確性較高。結論：PCR方法快速敏感、特異性高，相較于念珠菌傳統培養方法，是一種更加簡便理想的檢測方法。

[關鍵詞]口腔念珠菌；培養；聚合酶鏈反應

[中圖分類號]R783 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2011）09-01439-03

Application of PCR in rapid detection of oral candida

DENG Ni1，CHE Tuan-jie2，LEI Ke3，LIAO Tian-an1，HE Xiang-yi3

(1.Department of Stomatology，Hainan Provincial People's Hospital，Haikou 570311，Hainan，China;2.School of Life Science，Lanzhou University;3.School of Stomatology，Lanzhou University)

Abstract:ObjectiveThis study was performed to through PCR technology to find a rapid， accurate and effective detection that is used to detect oral candida. Methods Collecting 100 specimens of saliva， then culture these on CHROMagar media and detect by PCR. Results The positive rate of oral candida is 35% by traditional cultural detection while by PCR technology in two primers are 68% and 49% respectively. The traditional detections for candida are time-consuming，especially in culture method which consumes 48hrs at least;to apply PCR method to detect candidas only need 5hrs with high positive rate and accuracy. ConclusionTo compare with traditional culture method for Candidas，PCR technology is more perfect and handy.

Key words:candida;culture;PCR

隨著各種侵入性診斷治療手段如手術干預、化療、放療或聯合治療等的廣泛開展，以及各類免疫抑制制劑和廣譜、超廣譜抗生素的大量使用，自身免疫低下患者臨床上念珠菌感染的發病率明顯增高，已成為影響患者健康及威脅患者生命的重要原因。同時，念珠菌感染與很多口腔疾病相關，如口腔念珠菌病，口腔扁平苔蘚，口腔白斑等。其中，白色念珠菌作為口腔粘膜多種感染的致病因子的作用及其在白斑向癌轉變過程中的促進作用均已得到肯定[1]。因此，快速準確地檢測口腔念珠菌，對研究念珠菌對口腔的致病性和預防、監測口腔念珠菌感染都具有十分重要的意義。隨著分子生物學技術的飛速發展，聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)逐漸應用于臨床病原菌的檢測和鑒定。PCR方法快速敏感、特異性高，不僅能檢測出活力較高的致病菌，而且能檢測出活力較低而難以培養的真菌，為臨床檢測念珠菌提供了更有效的途徑。本研究將PCR技術應用于檢測口腔念珠菌中，尋找出一種能夠快速、準確、有效檢測口腔念珠菌的方法。

1材料和方法

1.1 菌種和試劑

1.1.1菌種：于蘭州大學口腔醫院采集100 例口腔唾液樣本。

1.1.2試劑和儀器：試劑： TE-TritonX-100裂解液， PCR試劑 (Taq酶、10×buffer、dNTP混合物、引物)，科瑪嘉念珠菌顯色培養基（科瑪嘉公司，法國）。主要儀器：PCR儀（MG-96+杭州朗基科學儀器有限公司），電泳儀（DYY－8c型，北京市六一儀器廠），電子恒溫培養箱（DNP-9162上海精宏）。

1.1.3引物選?。哼x擇檢測念珠菌常用的真菌通用引物①，以及一組念珠菌特異性引物②。

①：ITS4 5'TCCTCCGCTTATTGATATGC 3'

ITS86 GTGAATCATCGAATCTTTGAAC

②：ITS1 5'TCC GTA GGT GAA CCT GCG G3'

ITS4 5'TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3'

Ca15'GGT TTG CTT GAA AGA CGG TAG3'

Ca25'AGT TTG AAG ATA TAC GTG GTA G3'

Ct15'CAA TCC TAC CGC CAG AGG TTA T 3'

Ct25'TGG CCA CTA GCA AAA TAA GCG T3'

1.2 實驗方法

1.2.1 念珠菌菌株的培養、分離和鑒定：將100例臨床唾液樣本接種于科瑪嘉念珠菌顯色培養基(37℃，48h)進行培養，陽性樣本中挑取其中15例的單菌落移種于科瑪嘉培養基平板進行培養(37℃，48h)，在科瑪嘉培養基上傳代3次，以分離、純化?？片敿闻囵B基對照結果：白色念珠菌（綠色），熱帶念珠菌（藍灰色），光滑念珠菌（紫色），克柔絲念珠菌（粉色）。

1.2.2 菌體培養：挑取科瑪嘉顯色培養平板純培養的單菌落接種于3ml沙堡弱培養液，37℃振蕩培養48h。

1.2.3 DNA提取：將念珠菌液離心(10 000r/m，10min)，棄上清液，每份樣本加1ml裂解液（0.2mol/L Tris-HCl，1% SDS，0.25mol/L NaCl，0.025mol/L EDTA PH8.0），55℃ 1h，100℃煮沸15min，加3mol/L NaAc 50μl，-20℃放置20min，解凍后離心（10 000r/m，15min），取上清液加等體積的酚氯仿，充分混勻后離心（4℃，10 000r/m，10min），取上清液加2倍體積無水乙醇，-20℃放置20min，離心（4℃，10 000r/m，10min），棄上清液，70%乙醇洗管壁，槍尖吸干殘留乙醇，置超凈臺吹干，管底見透明膠狀DNA。加入200μl TE溶解沉淀。

1.2.4 DNA標化：將提取的15株念珠菌的DNA分別進行OD260和OD280檢測，所得OD260/280值都在1.5～2.0。將每種念珠菌的DNA標化為DNA含量為100ng/μl，作為模板。

1.2.5 基因擴增：分別以預先提取的念珠菌基因組DNA為模板進行PCR反應。反應條件為：模板10μl，引物1μl，10×buffer(Mg2+Free)5μl，dNTP 1μl，Taq酶(5U/μl)1μl，DMSO 0.5μl，補足ddH2O至終體積為50μl。反應程序為94℃ 3min 預變性；94℃ 15s 變性，55℃ 15s 退火，72℃ 30s 延伸，30個循環；72℃5min。

1.2.6 PCR產物檢測：PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后用凝膠成像系統分析。

1.2.7 測序驗證：挑選相同的樣本，用擴增出的單片段進行測序，測定的序列通過BLAST程序與數據庫中進行比對，根據同源性比對結果，確定序列來源，用來驗證改良多重PCR檢測口腔念珠菌菌種的準確性。

1.2.8 統計學分析：應用SPSS 13.0統計軟件進行分析，數據采用卡方檢驗進行統計。

2結果

2.1 培養結果如圖1。

2.2基因組DNA 提取：提取的念珠菌DNA均呈無色透明狀，經檢測所得DNA的OD值都在1.5～2.0，表明蛋白質等雜質去除較干凈，DNA純度較高，電泳結果條帶清晰、干凈，無拖尾現象，說明模板的完整性好，符合分子標記所需的高質量的模板要求。

2.3不同引物對模板產物的凝膠電泳檢測

2.3.1真菌通用引物②ITS4、ITS86進行擴增，擴增片斷的長度均在250bp左右（如圖2）。

2.3.2 念珠菌特異性引物③ITS1，ITS4；Ca1，Ca2；Ct1，Ct2進行擴增。擴增片段長度：白色念珠菌為550bp和150bp兩條帶，熱帶念珠菌為350bp，克柔念珠菌為550bp，光滑念珠菌為900bp（如圖3）。

2.4培養法與PCR法結果比較

2.5 PCR檢測結果的測序驗證

2.5.1測序驗證：挑選光滑念珠菌樣本，用擴增出的單片段進行測序，測定的序列通過BLAST程序與數據庫中進行比對，根據同源性比對結果，光滑念珠菌的相似率為99%（如圖4）。

3討論

念珠菌是一類條件性致病真菌，廣泛定殖于人類的各種腔道內，是最常見的深部真菌感染的病原菌。正常情況下，念珠菌和宿主之間保持著平衡，在健康人群陰道、口腔、腸道中可作為良性寄生菌與宿主共存，通常并不致病。但當宿主機體免疫功能下降時，這種平衡會被破壞，這些條件致病菌可作為念珠菌性陰道炎、口腔炎、甚至胃腸炎等深部念珠菌感染的致病因素[2]。通常，念珠菌可粘附于口腔的任何部位，念珠菌感染可引起很多口腔疾病，如口腔念珠菌病、口腔白斑、義齒性口炎、鵝口瘡等。念珠菌病也發生于食道中，引起疼痛和吞咽困難[3]。近年來，隨著各種侵入性診斷治療手段如手術干預、化療、放療或聯合治療等的廣泛開展，以及各類免疫抑制劑和廣譜、超廣譜抗生素的大量使用，自身免疫低下患者臨床上念珠菌感染的發病率明顯增高[4-5]。如何快速準確地檢測念珠菌成為臨床醫師面臨的一個重要問題。

目前，在臨床上，培養是檢測念珠菌的主要方法，但培養存在著耗時長，陽性率低的缺點，加之在感染早期侵襲的病原菌較少，對臨床診斷念珠菌感染有較大的影響。本實驗應用科瑪嘉念珠菌顯色培養基進行培養鑒定，培養時間為48hrs，100例口腔臨床樣本培養出念珠菌35株，陽性率為35%，培養時間長且陽性率較低，不能滿足臨床檢測的要求。

隨著現代分子生物學技術的不斷發展，應用分子生物學手段對念珠菌進行檢測成為可能，而且已成為研究的主要方向。傳統的檢測方法需要對樣品進行分離培養，往往要花上幾天乃至數周的時間，而且有些致病菌難以人工培養，給檢測帶來困難，而聚合酶鏈反應（PCR）技術的應用，克服了上述不足。與傳統生物檢測方法相比，PCR方法不僅檢測時間短、靈敏度高，還可以檢測出一些培養法不能檢測的微生物種類[6]。本實驗中應用引物①和②對100例樣本進行PCR檢測的結果分別為68株和49株，陽性率分別為68%和49%，同科瑪嘉培養法的檢出率35%相比，差異具有顯著統計學意義(P＜0.05)。同時，應用念珠菌特異性引物②還可分辨出不同的念珠菌，熱帶念珠菌，單一條帶，大小約350bp；白色念珠菌，2條帶，150bp和550bp；光滑念珠菌，單一條帶，大小約900bp；克柔念珠菌，單一條帶，大小約550bp[7]。通過測序驗證，證明應用PCR檢測念珠菌菌株的準確性高。同傳統的培養方法相比較，PCR具有特異性強、敏感性高、產率高、快速、簡便、重復性好，易自動化等特點。PCR 基因鑒定結果與臨床培養結果一致，直接PCR 法從取樣到獲得凝膠電泳結果，耗時約5h，與一般臨床念珠菌培養檢測3～5天相比，快速、省時，有助于臨床對真菌感染的早期快速診斷，且PCR方法操作簡單易于掌握，有望成為臨床常規使用的念珠菌診斷方法。

[參考文獻]

[1]徐巖英，胡碧瓊.口腔念珠菌及其致病性的研究[J].中華口腔醫學雜志，1997，32(3)：180.

[2]劉植華，鄧 瑛，李 晴.新生兒念珠菌感染母嬰垂直傳播的分子流行病學研究[J].中國臨床醫學，2003，10(5)：632-633.

[3]Stephens M.Understanding signs，symptoms and treatment of oral candidiasis[J].Nursing Times，2004，100(46):32-34.

[4]Shao PL，Huang LM，Hsueh PR.Invasive fungal infection－laboratory diagonsis and antifungal treatment [J]. Microbiol Immunol Infect，2006，39(3):178-188.

[5]Hsiao HH，Tsai HJ，Liu YC，et al.Invasive fungal infections in patients with acute leukemia [J].Kaohsiung J Med Sci，2006，22(5):217-222.

[6]彭會清，余盛穎，趙 歡.PCR技術在環境微生物檢測中的應用[J].資源環境與工程，2007，21(5)：610-612.

[7]李勁松，宋詩鐸，祁 偉，等.常見深部念珠菌感染快速基因診斷[J].中國感染控制雜志，2004，3(3)：198-201.

[8]金 欣，陳建魁，尹秀云.侵襲性真菌感染實驗室診斷研究進展[J].中國公共衛生，2007，23(11)：1401-1403.

[9]王 璐.真菌感染的臨床意義及實驗室檢測的研究進展[J].醫學動物防制，2005，21(6)：395-396.

[10]劉華偉，郭藹光，馬立農，等. PCR技術在沙門氏菌快速檢測中的應用[J].動物醫學進展，2004，25(6)：55-58.

[收稿日期]2011-03-10[修回日期]2011-04-25

編輯/何志斌