基因治療在口腔再生醫學領域中的研究進展

頜面部的創傷、炎癥、腫瘤、先天性畸形等均可造成牙齒、牙周組織、頜骨等口腔頜面部組織器官的缺損。現有的修復手段均存在一定的局限性，難以完全滿足臨床需要。1995年，Baum[1]首次描述了基因治療在口腔領域的應用前景。十六年來，隨著分子生物學、基因重組技術、再生生物學等基礎學科的迅猛發展，基因治療技術在口腔再生醫學領域的應用取得了較好的研究進展，已經成為國際口腔生物學和轉化醫學研究關注的熱點問題[2-6]。因此，本文將對基因轉移技術以及基因治療在口腔再生醫學臨床應用的最新進展綜述如下。

1基因治療的途徑和常用載體

基因治療技術，一種新的治療策略在口腔再生醫學領域中的應用發展迅速。基因治療通常采用兩種途徑，體外間接基因治療(ex vivo)和體內直接基因治療(in vivo) [3，6]。無論間接還是直接基因轉移都需要借助載體才能將外源基因轉入靶細胞內。目前載體系統主要分為病毒和非病毒兩種[3]，常用的病毒載體有腺病毒（AV），腺相關病毒（AAV），逆轉錄病毒（RV，包括慢病毒載體），單純皰疹病毒（HSV），雜合病毒等[7-9]。非病毒性載體有裸DNA、脂質體與脂質體復合物、納米顆粒等[3]。

2基因治療在口腔再生醫學中的應用

2.1 頜面骨組織再生：用于治療頜骨缺損的靶基因很多，作用機制和環節不盡相同，目前的研究主要集中于骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)基因。Park等[10]應用脂質體和腺病毒載體分別將BMP-2基因導入大鼠骨髓基質細胞(BMSC，bone marrow stromal cells)，比較了兩種載體的體外、體內成骨能力。體外實驗結果顯示腺病毒組的轉染效率是脂質體組的兩倍。當將基因修飾細胞復合明膠海綿植入大鼠下頜骨的骨缺損區，BMP-2可以在體內表達2 周以上，促進了下頜骨骨缺損的修復，其中腺病毒組4周后骨缺損幾乎完全愈合，而脂質體組相對新骨形成速度較慢，6周后骨缺損基本愈合，陰性對照組8周時仍未見骨愈合。Zhao等[11]用腺病毒介導的BMP-2轉染BMSC細胞，結合磷酸三鈣支架材料可以修復下頜骨的缺損，獲得礦化密度較高的新生骨。Chang等[12]應用腺病毒載體攜帶BMP-2，體外修飾BMSC，并植入小型豬的上頜骨缺損區，實驗組的骨缺損在3個月后完全修復，組織學觀察顯示新生骨為成熟的編織骨且鈣化良好。近期，Ke等[8]應用安全性較好的AAV病毒載體介導BMP-2體外修飾BMSC，并將其植入兔子的上頜骨缺損，頜骨缺損的修復能力顯著提高。Ashinoff等[13]研究通過腺病毒介導的BMP-2 對大鼠下頜骨牽張成骨的影響。實驗結果表明，實驗組在牽張成骨部位新骨形成量顯著增加。

BMP基因治療在促進頜骨組織再生中的應用非常廣泛，近來也有一些研究報道了其他治療基因的應用，例如堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor， bFGF），音波刺猬因子（sonic hedgehog，SHH）等。Jiang等[14]將腺病毒介導的bFGF基因修飾的骨髓基質干細胞移植入兔子下頜骨牽張成骨區域，可以有效地促進更多的新骨形成。Edward等[15]將逆轉錄病毒介導的Shh修飾的三種細胞(牙齦纖維細胞、間充質干細胞、脂肪來源細胞)復合I型膠原植入兔的顱骨缺損處，6周后通過X線片、組織學觀察，骨組織缺損區域幾乎完全修復，同時機體沒有出現任何不良反應。

頜骨的生長調控需要多因子的協同作用，多個治療基因的聯合應用也取得了一定進展。Koh等[16]的研究證實通過基因治療的同時表達兩種成骨因子BMP2和BMP7，表現出了更強的骨組織再生能力。通過X線片，Micro CT和組織學切片進行檢測，4周后 BMP2和BMP7的聯合基因轉染組，其成骨能力顯著高于單個基因轉染組，表現為顱骨缺損區域幾乎完全修復，甚至個別缺損區的成骨量更致密，顯著高于陰性對照組。另外，將促血管生成因子與成骨因子聯合應用，可以更好地協同促進頜骨組織再生。Peng等[17]的研究表明單獨應用VEGF并不能促進骨的再生，但是將VEGF和BMP4基因共同修飾MDSC，并與明膠海綿共同植入小鼠的顱骨缺損區域后，血管新生和新骨形成能力顯著增強。

2.2 顳下頜關節組織再生：顳下頜關節的組織工程需要促進功能性骨和軟骨組織再生，并需要建立適當的骨-軟骨交界區。 Schek等[18-19]將分化的豬軟骨細胞和Ad.BMP7基因修飾的人牙齦纖維細胞復合到生物支架中，并將復合物移植到免疫缺陷小鼠的皮下，4周后構建了一種骨-軟骨組織，包括血管化骨，成熟的軟骨以及清晰的礦化界面。另一項研究進展是將基因直接導入下頜髁突，1999年，Kuboki等[20]用腺病毒載體攜帶B-半乳糖苷酶基因直接體內法注射到豚鼠顳下頜關節上腔，4周后發現，關節軟骨表面和滑膜均有B-半乳糖苷酶的穩定表達，從而證明了腺病毒介導基因治療顳下頜關節疾病的可行性。Rabie等[21] 用AAV病毒載體介導了治療基因VEGF感染了大鼠的髁突組織，體內試驗證明VEGF的表達增強，促進了下頜髁突的軟骨內成骨進程。Li等[22]用AAV病毒載體攜帶Vastatin基因，局部注射到顳下頜關節后區，進一步證明轉基因不僅表達在髁突軟骨，而且在關節盤和關節窩都有持續的表達。這些研究為生理性骨-軟骨結構的構建以及TMJ局部基因治療的應用前景提供了實驗依據。

2.3 牙周組織再生：牙周病造成牙周支持組織破壞及牙周附著喪失，是導致牙齒缺失的最主要原因。牙周病治療的目的不僅在于控制炎癥，更在于使已經破壞的牙周組織再生以形成新附著。牙周組織再生包括因炎癥破壞吸收的硬組織(牙槽骨與牙骨質)和軟組織(牙周膜與牙齦)。Jin等[23]將攜帶血小板衍生生長因子-B（plateletderived growth factor-B，PDGF-B）的腺病毒直接注射于牙周缺損處，結果顯示，病毒感染組牙槽骨的修復4倍于對照組，而牙骨質的修復則6倍于對照組，提示應用PDGF- B 基因治療可以促進牙周的修復潛能。Chang等[24]的進一步研究證實在牙周骨缺損處直接局部注射腺病毒介導的PDGF-B 是安全可靠的，沒有發現治療引起的機體不良反應。盡管2周內在缺損局部可以檢測到病毒載體的DNA， 隨著時間的推移病毒載體的量逐漸衰減?？梢奝DGF-B基因轉染可有效地促進細胞增殖和缺損的充填，證實了基因轉入牙周細胞可以為牙周再生提供一個便捷的途徑。

2.4 牙體組織再生：牙再生的研究是口腔再生醫學研究中最為活躍的領域。Rutherford等[25]采用了體外間接基因轉染方式，將攜帶BMP-7的腺病毒載體感染培養的成體纖維細胞，然后將修飾后的細胞與膠原復合植入白鼬炎性牙髓組織中，研究發現BMP-7的基因轉染促進了修復性牙本質的形成。Nakashima等[26-27]用電穿孔（Electroporation）的方法將分化因子（Gdf1）轉染到培養的小鼠牙髓細胞中可以在體外促進其向成牙本質細胞轉化。Nakashima等[28]又用超聲波的方法轉染Gdf1，發現它還可以促進犬的自體牙髓干細胞分化為成牙本質細胞，同時在犬的模型上修復性牙本質的形成增加，其中管狀牙本質的再生最為明顯。可見，通過轉染特異性基因和生長因子進入成體牙細胞，為促進組織工程牙的形態發生提供了新的思路。

3基因治療的前景展望

成功的基因治療必須包括選擇適當的治療基因、適當的轉導，使其在體內獲得安全、持續和可調控的表達?？谇辉偕t學領域的基因治療，雖然在動物試驗上取得了一些初步經驗，但是離真正的臨床推廣應用還有相當長的一段距離。將來的研究將著眼于以下幾個方面：①對于目的基因，仍需進一步明確何種基因或多種基因的聯合應用；②選擇與構建一個安全、高效、可調控的甚至是具有組織特異性的靶向基因載體仍是基因治療面臨的重要問題；③在基因轉導方法上仍需決定最佳基因載體或者靶細胞的數量、最佳轉入體內的時機，以及減少不良反應以達到最佳治療效果。隨著現代分子生物技術日趨成熟和基因工程研究的深入，相信這些問題在不遠的將來都會得到解決。

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[收稿日期]2011-06-07 [修回日期]2011-08-01

編輯/李陽利