Rac1及Ki-67因子在人翼狀胬肉中的表達

[摘要]目的：研究Rac1蛋白和Ki-67在人翼狀胬肉中的表達，分析二者在翼狀胬肉表達的相關性，探討利用Rac1作為標記物評估翼狀胬肉生物學特性，為臨床診療提供參考。方法：應用辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素免疫組織化學方法(S-P法)對39例原發性翼狀胬肉及12例正常球結膜組織中的Rac1及Ki-67蛋白進行檢測。結果：Rac1及Ki-67蛋白在翼狀胬肉組織中的表達均高于正常結膜組，差異有顯著性意義（Z=-3.386，Z=2.707，P均＜0.05）。Rac1及Ki-67蛋白表達之間的相關系數r=0.384，差異無顯著性意義（P＞0.05）。結論：Rac1及Ki-67在翼狀胬肉中的高度表達，提示翼狀胬肉在細胞骨架，基底膜分解代謝和細胞增殖活躍方面發生了變化。

[關鍵詞]Rac1；Ki-67；翼狀胬肉；免疫組織化學

[中圖分類號]R730[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2011）10-1566-03

Rac1 and Ki-67 factor expression in human pterygium

GU Qiu-yan

(Teaching and Research Section of Ophthalmology，Xingtai Medical College，Xingtai 054000，Hebei，China)

Abstract:ObjectiveTo study the expression of Rac-1 and Ki-67 in primary pterygium by immunohistochemical method. The relationship among them was analyzed. The possibility was discussed utilizing of Rac1 and Ki-67 as a marker for assessment of biological characteristics ofpterygium and we tried to provide reference for clinical practice. MethodsImmunohistochemistry was used to measure the expression of Rac1 and Ki-67 in 39 cases of primary pterygium and 12 cases of normal conjunctiva.ResultsThe expression of Rac-1 and Ki-67 in primary pterygium were higher than normal conjunctiva with the difference being significant (Z=-3.386，Z=2.707，both P<0.05). Expression of Rac1 and Ki-67 expression was negatively correlated (r=0.384，P＞0.05).ConclusionRac1 and Ki-67 expression in the height of pterygium， suggesting that pterygium in the cytoskeleton， basement membrane breakdown and cell proliferation activity in metabolic changes.

Key words: Rac1; Ki-67; pterygium;immunohistochemistry

翼狀胬肉是常見的眼表疾病之一，表現為呈三角形增厚的球結膜組織病變。其頭部侵襲生長入角膜，體部位于瞼裂區的一側，造成患者美容缺陷。胬肉侵入角膜后還可導致散光、角膜像差改變等視功能損害[1]。組織病理學改變主要表現為結膜組織高度纖維血管化及纖維組織侵入角膜Bowman層及基質淺層。生物學上表現為具有一些腫瘤樣特性：輕度發育不良、局部浸潤性和高復發率等。

Ras 相關的C3肉毒素底物1(Rac1)通過調節肌動蛋白細胞骨架，促進細胞運動。當Rac1被激活后，可參與肌動蛋白應力纖維和粘附斑形成，促進細胞骨架結構重組，影響細胞的形體極化，增強細胞運動遷移。Rac1在多種腫瘤組織中的表達明顯升高，且其與侵襲、轉移密切相關。Ki-67是一種存在于增殖細胞核基質內的抗原，其增殖指數可以敏感地反映出細胞的增殖活性。翼狀胬肉組織存在異常增殖調控，使胬肉上皮及間質細胞和正常結膜處于不同細胞分裂周期。

本研究采用免疫組化法檢測39例翼狀胬肉，12例正常球結膜標本中Rac1和Ki-67的表達，并分析這二者在翼狀胬肉中表達的情況及相關性，從分子水平進一步探討其發病機制，為深入研究和積極治療翼狀胬肉提供理論依據。

1材料和方法

1.1 標本來源：原發性翼狀胬肉組織標本共39例，均取自2009年3月～2009年7月在河北省眼病治療中心行翼狀胬肉切除術的患者。其中男性21例，女性18例；平均年齡60.5歲；靜止期12例，進展期27例。病程6個月～30年不等；生長部位：鼻側38例，顳側1例；對照組取正常球結膜12例，取材部位為鼻側瞼裂部近角鞏膜緣球結膜組織。其中男性7例，女性5例；平均年齡41.2歲。所有病例術前均排除其他角膜及結膜疾病，近3個月無眼部用藥史及手術史。

1.2 實驗試劑：兔抗人Rac1多克隆抗體購于美國Abcam公司（產品編號ab78139-100）；鼠抗人Ki-67單克隆抗體濃縮液（北京中杉金橋生物技術有限公司），產品編號ZM-0166；S-P免疫組化試劑盒、濃縮型顯色劑二氨基聯苯胺（DAB）試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 方法：免疫組織化學染色（S-P法）：標本經10%中性福爾馬林固定24h后進行常規脫水、透明、浸蠟、包埋。5μm連續切片后，經二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水；于濕盒內用3%H2O2溶液室溫孵育20min去除內源性過氧化氫酶；枸櫞酸鹽緩沖液微波抗原熱修復；正常山羊血清封閉；分別滴加由0.01M PBS稀釋的Rac1及Ki-67的一抗，工作濃度分別為1:600及 1:50，切片放入濕盒中，4℃冰箱過夜；分別滴加生物素標記的二抗工作液及辣根酶標記鏈霉卵白素工作液， 37℃溫箱孵育30min；DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，自來水充分沖洗中止顯色。蘇木素復染，常規脫水透明封片。以0.01M 磷酸鹽緩沖液（PBS）液替代一抗做陰性對照，將已知陽性切片作為陽性對照。

1.4 結果判定：Rac1蛋白的表達情況根據染色強度及染色陽性細胞的百分率來計分。陽性細胞數≤10%為0分；在10%～25%為1分；在26%～50%為2分；＞51%為3分；染色強度計分標準：無色計0分；淡黃色計1分；棕黃色計2分；黃褐色計3分。分值計算：將兩種計分結果相乘并分為以下等級：0分：為陰性(－)；1～2分：為弱陽性(+)；3～4分：為陽性(++)；5分～：為強陽性(+++)。Ki-67定位于細胞核，陽性反應為細胞核呈棕褐色、顆粒狀。Ki-67蛋白評分標準：在400倍視野下計數500個細胞，陽性細胞＜5%為陰性（－），5%～25%為弱陽性（+），26%～50%為陽性（++），＞50%為強陽性（+++）。＞25%即為Ki-67高表達。

1.5 統計學方法：所有數據采用SPSS15.0統計軟件包進行秩和檢驗和Spearman等級相關分析。以a=0.05為檢驗水準，P＜0.05為差異有顯著性。

2結果

2.1 Rac1蛋白的表達：正常球結膜組織中未見Rac1表達（圖1），翼狀胬肉組織中Rac1的陽性物質位于上皮層細胞的胞漿中，呈彌漫性或散在分布的棕黃色或棕褐色顆粒狀（圖2），差異有顯著性意義(P＜0.05) （表1）。39例翼狀胬肉標本中，靜止期Rac1陽性表達率為58.3%(7/12)，進展期陽性表達率為59.2%(16/27)，靜止期和進展期翼狀胬肉的Rac1陽性表達率比較無顯著性差異(P＞0.05)。不同性別和不同年齡組Rac1陽性表達亦無顯著性差異(P＞0.05)（表1）。

2.2 Ki-67蛋白的表達：正常球結膜組織中僅有少量上皮層的基底細胞表達Ki-67，陽性率為25%（3/12）（圖3）。翼狀胬肉Ki-67的陽性表達主要分布在上皮組織，以上皮的基底細胞為明顯，染色呈細胞核型，為棕黃色到棕褐色顆粒，基質層亦有少量表達（圖4）。Ki-67在翼狀胬肉中的陽性表達高于正常結膜組織，差異有顯著性意義(P＜0.05)。39例翼狀胬肉標本中，靜止期Ki-67陽性表達率為33.3%) (4/12)，進展期陽性表達率為77.8%(21/27)，進展期Ki-67蛋白表達明顯高于靜止期，統計學處理有顯著性差異(P＜0.05)。不同性別和不同年齡組Ki-67陽性表達亦無顯著性差異(P＞0.05)（表1）。

2.3 翼狀胬肉Rac1與Ki-67表達相關性分析：胬肉中Rac1和Ki-67的表達分別進行Spearman等級相關分析，二者表達不具相關性（r=0.384，P＞0.05）（表2）。

3討論

Rac1基因位于人染色體7p22，其編碼產物是小G蛋白Rho(Ras homologue)家族重要成員。Rho家族蛋白可以通過多種途徑參與和調節細胞的生長、凋亡和細胞周期的變化。Rac1是其重要成員之一，作為重要的細胞骨架結構調節因子，與腫瘤的惡性轉化、侵襲、轉移都密切相關。Rac1蛋白具有Rac1-GDP(失活狀態)和Rac1-GTP(激活狀態)兩種形式，其生物功能的發揮依賴于此兩種活性形式間的轉換，且具有調節細胞骨架重組，影響細胞形體極化，促進細胞運動與遷移，抑制細胞凋亡的作用[2]。這可能導致翼狀胬肉形成異常增殖、構建新的血管網及細胞外基質的改變等，最終導致了新的血管纖維組織的形成[3]。近年研究表明，Rac1在結腸癌、肺癌、乳腺癌和卵巢癌等腫瘤組織表達明顯升高，且與侵襲、轉移密切相關[4] 。在大多數胃腸道腫瘤細胞系中亦有表達[5]。翼狀胬肉過去認為由于過多紫外線照射所引起的一種退行性病變。但組織病理學可見侵入角膜的胬肉組織顯示是結膜組織中轉移的上皮細胞和成纖維細胞[6]。有免疫組化實驗研究顯示翼狀胬肉屬于一種良性增殖性病變[7]。臨床上胬肉則表現為新生的組織不斷生長、增厚并逐漸侵入角膜，且手術切除后復發率高，這些證據表明翼狀胬肉不僅不是退行性病變，而是一種良性腫瘤樣病變[8]。

本研究首次采用免疫組化方法證實，人翼狀胬肉上皮組織Rac1呈陽性表達，39例中的陽性表達率為59%（23/39），正常球結膜組織未見Rac1陽性表達。結果表明翼狀胬肉Rac1陽性表達明顯高于正常結膜組織（P＜0.05)。本研究的結果支持翼狀胬肉具有腫瘤特性這一學說。雖然翼狀胬肉上皮并未觀察到形態學的異型性，但本研究發現近60%翼狀胬肉上皮組織呈Rac1陽性表達，而正常結膜組織陰性表達，說明翼狀胬肉上皮的生物學特性已經發生變化，因此我們認為Rac1既可作為反映翼狀胬肉生物學行為的一個新型標志物，有助于預測胬肉的浸潤情況，也為翼狀胬肉術后的高復發率提供了理論依據。

Ki-67抗原是1983年由Gerdes等發現在增殖細胞中表達的一種核抗原，也是目前較為肯定的核增殖標志基因。Ki-67的表達出現于G1中期到晚期，S期和G2期逐漸增加，有絲分裂期達高峰，分裂后迅速降解或丟失抗原決定簇，到G0期則不表達，半衰期為1h或更短。幾乎所有組織中都有Ki-67表達，它是一個反映細胞增殖率的可靠指標，其高表達是細胞增殖活躍的重要標記，多種腫瘤組織都有Ki-67高表達[9]，Ki-67對腫瘤的轉移及預后判斷也具有重要意義。

本研究結果顯示，Ki-67在翼狀胬肉近基底膜的上皮細胞層呈陽性表達。39例翼狀胬肉組織中的陽性表達率為64.1%（25/39）明顯高于正常球結膜組織，與他人研究結果一致[10]。說明翼狀胬肉組織存在異常的增殖調控，胬肉的上皮及間質細胞和正常結膜處于不同的細胞分裂周期，導致組織過度增殖。進展期胬肉Ki-67陽性表達（77.8%）明顯高于靜止期胬肉（33.3%），經統計學分析具有顯著性差異（P＜0.05)。說明進展期翼狀胬肉細胞的增殖活躍，翼狀胬肉組織中存在增殖調控異常。

綜上所述，本研究首次發現Rac1在翼狀胬肉上皮組織高表達。Rac1及Ki-67在翼狀胬肉中的表達明顯均高于正常球結膜，說明翼狀胬肉在細胞骨架、ECM分解代謝和細胞增殖方面表現出腫瘤組織的生物學特性，提示Rac-1介導的活化機制在翼狀胬肉的侵襲過程中可能起重要作用。

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[收稿日期]2011-06-10[修回日期]2011-08-12

編輯/張惠娟