Ad-EGFP修飾的MSCs在糖尿病足潰瘍大鼠體內的示蹤及療效觀察

[摘要]目的：觀察自尾靜脈移植Ad-EGPF修飾的大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)在糖尿病足潰瘍模型大鼠胰腺、腎臟及潰瘍局部的示蹤情況，并觀察移植后大鼠血糖、體重及潰瘍面積的改變情況。方法：貼壁法體外分離培養Wistar大鼠BMSCs，傳代培養后用攜帶增強型綠色熒光蛋白基因的腺病毒(Ad-EGFP)以感染復數(MOI=150)體外轉染。60 只Wistar大鼠，雌雄各半，隨機分為3 組；糖尿病治療組(糖尿病足潰瘍大鼠細胞移植治療組)、糖尿病對照組(糖尿病足潰瘍大鼠PBS對照組)使用鏈脲菌素(STZ)誘導糖尿病模型后，連同正常對照組(正常足潰瘍大鼠PBS對照組)制作足部潰瘍模型。造模成功后，糖尿病治療組經尾靜脈注射轉染Ad-EGFP 72h后的BMSCs懸液0.5 ml(細胞數5×106個)，糖尿病對照組及正常對照組注射等量PBS溶液。分別于細胞移植后7 天、14 天、21 天測量體重、空腹血糖水平、足部潰瘍面積；并于細胞移植后14 天，觀察BMSCs在胰腺、腎臟及足潰瘍局部的分布情況。結果：移植后14天可在糖尿病大鼠胰腺、腎臟及皮膚潰瘍面觀察到Ad-EGFP標記的BMSCs. 糖尿病治療組大鼠體重明顯恢復、血糖顯著降低、足潰瘍愈合加速，與糖尿病對照組相比，差異均具有統計學意義(P＜0.05)。結論：BMSCs具有歸巢特性，并可能對糖尿病及足潰瘍有一定的治療效果。

[關鍵詞]骨髓間充質干細胞；糖尿病；潰瘍；移植；歸巢

[中圖分類號]R332[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2011）10-1571-04

Study of diabetic foot ulcer transplanted with bone marrow mesenchymal stem cells transfected with Ad-EGFP in rats

LIANG Wen-Jia1， CAI Qian2， LIU Yi2

(1.Second Clinical Medical College， Lanzhou University，Lanzhou 730000，Gansu，China; 2.Department of Burns and Plastic Surgery， Lanzhou General Hospital of Lanzhou Area Command of Chinese PLA，Lanzhou 730050，Gansu，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the distribution of rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) transfected with Ad-EGFP in kidney and pancreatic tissues， and the variation of blood glucose， weight and ulcer area after cell transplantation， in model rats of diabetic foot ulcer.MethodsMSCs isolated from Wistar rats were cultured in vitro and were then transfected with green fluorescent protein (Ad-EGFP) at the multiplicities of infection (MOI) of being 150. The BMSCs were obtained for transplantation. Sixty Wistar rats were randomly assigned to 3 groups: diabetic treatment group (diabetic foot ulcer rat treated with the transfected BMSCs)， diabetic control group (diabetic foot ulcer rat treated with PBS) and normal control group (normal ulcer rat treated with PBS). The two groups of diabetic rat model were achieved by intraperitoneally injection of streptozotocin. Foot ulcer for the three groups was manually scratched. For rats in diabetic treatment group， 0.5 ml BMSCs (cell count 5×106) obtained 72 hours after transfected with Ad-EGFP were injected via tail vein， while these in two control groups were injected with PBS of same volume. The variation of blood glucose， weight and ulcer area were observed on the 7th， 14th and 21th after cell transplantation， and the distribution of BMSCs in kidney and pancreatic tissues in rats on diabetic treatment group were examined.ResultsIn diabetic treatment group， the BMSCs were detected at pancreas， kidney and foot ulcer after 14th day of transplantation. As compared to control group， therapy using the BMSCs decreased blood glucose level， improved symptom of magersucht and accelerated the healing of ulcer.ConclusionThe results indicated BMSCs had the capability of nesting and may have beneficial effects in the management of diabetics and associated foot ulcer.

Key words: bone marrow mesenchymal stem cells; diabetics; ulcer; transplantation; nesting

胰島β細胞功能障礙導致胰島素分泌不足以維持機體血糖的穩定是糖尿病的主要發病機理[1]。骨髓間充質干細胞(BMSCs)是一類來源于中胚層的干細胞，可跨胚層分化為各類細胞，其容易分離和培養擴增，自我更新能力強，可塑性高，對受損的組織和器官具有較強的修復能力，在糖尿病及其并發癥的治療中具有一定優勢。因此，本實驗經大鼠尾靜脈異體移植BMSCs，初步觀察其在胰腺、腎臟及潰瘍組織中的存活及轉歸，期望從體內角度分析BMSCs在糖尿病及其并發癥的治療中的可行性及應用前景。

1材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級Wistar大鼠5只，體質量(100 ±20)g，用于BMSCs的分離、培養；SPF級Wistar大鼠60只，體質量(200±20)g，均由甘肅省中醫學院提供。

1.1.2 試劑及儀器：Ad-EGFP (本實驗室構建)；DMEM-F12培養基和胰酶(GIBCO公司)；胎牛血清(蘭州民海公司)；鏈脲菌素(STZ) ( Sigma公司)；血糖試劑盒(四川邁克科技公司)；CO2細胞培養箱(Heracell公司)；超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)；熒光倒置顯微鏡(Olympus公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠MSCs的分離、培養及純化：SPF級Wistar大鼠，（100 ±20）g，脫頸處死后，于超凈工作臺內無菌取出雙側股骨、脛骨，用DMEM-F12培養液沖出骨髓，采用全骨髓貼壁法培養，37℃、5% CO2孵箱內培養72 h后更換新鮮培養液，去除未貼壁細胞，以后每3 天換液1次。待細胞長至80%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，l:3比例傳代。

1.2.2 重組腺病毒載體Ad-EGFP轉染大鼠BMSCs：3代BMSCs接種于10mm培養皿，待生長至80%融合后，棄去上清，加入含Ad-EGFP腺病毒的DMEM-F12培養液(MOI=150)孵育2h后，將培養液更換為含5%FBS的DMEM-F12培養液，37℃、5%CO2孵箱培養，48h后熒光顯微鏡觀察綠色熒光強度。

1.2.3 動物模型制備及細胞移植：60只SPF級Wistar大鼠，體重(200±20)g，雌雄各半，隨機分為：糖尿病治療組(糖尿病足潰瘍大鼠細胞治療組)、糖尿病對照組(糖尿病足潰瘍大鼠PBS對照組)及正常對照組(正常足潰瘍大鼠PBS對照組)。前兩組高脂飼料(向標準混合飼料中添加含10%豬油、2.5%蛋黃及20%蔗糖高脂高糖成分)喂養2個月后，腹腔內注射鏈脲菌素1次(30mg/kg)，正常對照組采用標準混合飼料喂養2個月后，腹腔內注射等量檸檬酸緩沖液。一周后眼球后靜脈叢采血測量血糖，空腹血糖 ≥16.7mmol/L視為大鼠糖尿病造模成功。3組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，足背部作一3mm×7mm的矩形切口并移除全層皮膚，視為足部潰瘍造模成功(記為第0天)。于第1天，細胞移植組經尾靜脈注射轉染Ad-EGFP 72 h后的BMSCs懸液0.5ml(細胞數5×106個)，其余兩組注射等量PBS溶液。

1.2.4 觀察指標：①分別于細胞移植后7 天、14 天、21 天測量體重、空腹血糖水平及足部潰瘍面積；②細胞移植后14 天，斷頸處死，取胰腺、腎臟及潰瘍創面新鮮組織，立即冰凍切片，片厚7μm，熒光顯微鏡下觀察EGFP-BMSCs在胰腺、腎臟及潰瘍局部的分布情況。

1.2.5 統計學方法：采用SPSS11.0統計軟件對所測數據進行分析，計量資料用均數±標準差表示，兩個均數比較用t檢驗，多組均數比較采用單因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1 Ad-EGFP轉染大鼠BMSCs：應用Ad-EGFP轉染大鼠BMSCs(MOI=150)，轉染效率可達88%以上，轉染48 h后，細胞熒光明顯增強(圖1)，熒光倒置顯微鏡下可見發綠色熒光的BMSCs呈寬大扁平形及梭形分布。熒光強度3～5 天達到頂峰，40 天后仍能觀察到熒光。

2.2 移植后體重變化：正常對照組體重基本穩定，糖尿病對照組體重呈持續下降趨勢。糖尿病治療組在移植后7 天內體重呈下降趨勢，14天已開始上升，至21天接近正常對照組水平，差異無統計學意義(P=0.098)；與糖尿病對照組相比差異有統計學意義(P＜0.05) ；與細胞移植后7天相比，體重增加約18%，差異有統計學意義(P＜0.05)（圖2）。

2.3 移植后血糖變化：糖尿病治療組血糖在移植后7 天內與糖尿病對照組相比尚無差異，14 天逐漸降至(19.68± 0.73)mmol/L，21 天降至(17.35±0.89) mmol/L，與0 天相比差異有統計學意義(P＜0.05)；糖尿病對照組血糖穩定在較高水平，21 天達(25.32±1.67)mmol/L，與糖尿病治療組相比差異有統計學意義(P＜0.05)。糖尿病對照組及正常對照組血糖移植前后差異均無統計學意義（圖3）。

2.4 移植后潰瘍面積比較：見圖4。由圖可見，足潰瘍造模當天(0 天)三組潰瘍面積比較后無統計學差異，從7 天開始到21 天，正常對照組愈合情況明顯優于糖尿病治療組和糖尿病對照組(P＜0.05)；14 天開始，糖尿病治療組愈合效率開始高于糖尿病對照組(P＜0.05)。

2.5 EGFP-BMSCs在胰腺、腎臟及潰瘍局部的分布情況：細胞移植后14 天，糖尿病治療組大鼠胰腺、腎臟及潰瘍局部組織中出現Ad-EGFP標記的BMSCs細胞，提示BMSCs能定位于胰腺、腎臟及潰瘍創面中，見圖5～7。

3結論

BMSCs是自我更新能力極強的一類具有多向分化潛能的非造血干細胞，其具有免疫原性低，取材方便，體外增殖能力較強的優勢，且具有調節炎癥介質、旁分泌生長因子類物質及良好的歸巢作用[2-3]，大量的基礎研究和初步臨床試驗結果肯定了BMSCs移植對缺血性心肌疾病、骨、軟骨、角膜、皮膚及軟組織再生的治療作用。Ezquer[4-5]等在STZ誘導糖尿病小鼠體內靜脈移植BMSCs的實驗研究中也證實了BMSCs可明顯改善小鼠高血糖癥狀、促進胰島β細胞再生及阻止腎臟損害；同時發現從糖尿病小鼠體內分離培養的干細胞與正常小鼠干細胞相比，存在細胞表型改變、成骨不良及增殖潛能明顯減退的現象，為BMSCs治療糖尿病提供了進一步的理論支持。治療糖尿病難愈性創面的動物實驗研究表明，BMSCs移植后能分泌血管源性因子及分化為血管內皮細胞，進而促進毛細血管新生，加速創面愈合[6-7]；國外用自體BMSCs移植治療糖尿病足潰瘍的臨床試驗也顯示了較好的促潰瘍愈合效果[8]。

本研究給予實驗動物低劑量STZ破壞了部分胰島β細胞功能，配合高脂飼料可造成外周組織對胰島素不敏感，兩者結合便誘導出接近人類2型糖尿病的動物模型，且具有成模率高及死亡率低的優點，是一種簡便可行的方法。創面愈合的過程是由細胞、細胞外基質及細胞因子等多因素共同協同作用的復雜病理生理過程，分為相互重疊的4個時相：凝血期、炎癥期、細胞增生期和修復塑行期。由于糖尿病患者血糖持續在較高水平，非酶促糖基化反應加速晚期糖基化終產物蓄積，使機體內環境協調功能障礙，導致創面長期難以愈合[9]；而在臨床實踐中，糖尿病潰瘍多發生于足部，且截肢風險高，故本實驗選擇糖尿病足部潰瘍大鼠模型，以觀察靜脈移植BMSCs能否在潰瘍局部示蹤及是否具有促愈合作用。

本實驗結果顯示BMSCs可以定位于糖尿病大鼠胰腺、腎臟及皮膚潰瘍面，并在明顯降低糖尿病大鼠血糖及改善消瘦癥狀的同時，加速足部潰瘍的愈合；細胞移植后大鼠血糖雖未降至正常水平，潰瘍愈合效果也不及正常對照組大鼠，但與糖尿病空白對照組相比有一定效果。表明BMSCs具有歸巢特性，可能對糖尿病具有一定的治療效果，治療機制可能是BMSCs歸巢后的旁分泌及定向分化潛能，仍待進一步研究。

因STZ是通過破壞胰島β細胞功能而致糖尿病，因此胰腺組織破壞最嚴重，高表達許多種趨化因子，誘使BMSCs 向著胰腺歸巢；糖尿病往往伴隨有腎臟的損害，故腎臟組織也可見到干細胞歸巢現象。糖尿病患者下肢動脈慢性閉塞，形成的潰瘍因組織缺血缺氧而遷延不愈，靜脈給藥對于下肢血流尚通暢的還有一定效果，對于下肢血流阻塞的效果卻不理想。該實驗在2型糖尿病模型造模成功后1周即開始給予靜脈BMSCs移植治療，下肢微血管病變尚未形成血流完全閉塞的情況，故靜脈移植細胞后在潰瘍局部可見BMSCs. 然而，就干細胞是因為降低血糖才促進創面愈合的，還是直接的促創面愈合機制，有待進一步研究。

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[收稿日期]2011-06-11 [修回日期]2011-08-14

編輯/張惠娟