CaMKIV在免疫細胞中的作用

基金項目：福建省自然科學基金（C0710017）

作者單位：350001 福建醫科大學附屬內分泌研究所

通訊作者：游捷

【摘要】 鈣調蛋白激酶（CaMK）IV是Ca²⁺信號轉導過程中的一個關鍵激酶，主要表達在神經組織和免疫系統。研究表明，在經過一系列級聯反應激活后，CaMKIV轉位至細胞核，通過調節轉錄因子CREB、MEF2及AP-1等活性，參與調節T細胞發育和激活，樹突狀細胞分化和存活，以及骨髓造血干細胞的維護。新近關于骨免疫學方面的研究顯示，CaMKIV參與調節免疫應答，本文針對部分表達該蛋白的免疫細胞，探討CaMKIV在免疫炎癥中的作用。

【關鍵詞】 鈣調蛋白激酶IV； 炎癥反應； T淋巴細胞； 樹突狀細胞

Ca²⁺是一個通用而普遍存在的第二信使，廣泛參與各種基礎細胞進程，鈣調蛋白（CaM）是Ca²⁺的一個主要受體，在所有真核細胞中表達。Ca²⁺與CaM結合形成復合體，使得CaM內部構象改變，進而可與許多不同靶酶相互作用，這些靶酶中較重要的是鈣調蛋白激酶（CaMKs）家族，包括磷酸化酶激酶、肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）、CaMKⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ^［1］。CaMKs家族目前研究較多的是CaMK Ⅱ和Ⅳ，主要在神經組織和免疫系統。

1 CaMKIV概述

1.1 基因和蛋白 CaMKIV主要表達于腦組織和胸腺，脾臟、卵巢和睪丸也有少量表達。在免疫系統中表達于T細胞、樹突狀細胞、造血干細胞，在B細胞及單核細胞中未見報道。編碼CaMKIV的基因由42 kb DNA組成，包括12個外顯子和11個內含子，由于剪接差別和轉錄起始位點的不同，能夠產生多種mRNA。CaMKIV的分子量約為60 KDa，基本結構包括一個N-末端激酶區域，一個自動調整區域和一個重疊的CaM結合區域。CaMKIV蛋白包括α、β兩種亞型，后者包含一個由28個氨基酸殘基組成的N-末端擴展，其余結構基本相同^［2］。

1.2 激活過程 在細胞質中CaMKIV是一個由鈣調蛋白激酶激酶（CaMKK）和蛋白磷酸酶2A（PP2A）組成的復合體，是無活性的。當胞內Ca²⁺濃度增加時，部分Ca²⁺結合CaM，然后Ca²⁺/CaM復合物結合CaMKIV，由于Ca²⁺/CaM的結合位點與PP2A相同，故而取代PP2A，并且使得CaMKIV構象改變，進而使CaMKIV具備最基礎的激酶活性，暴露出可被CaMKK磷酸化的活性環。CaMKK磷酸化Thr²⁰⁰（在鼠類為Thr¹⁹⁶）位點，使CaMKIV完全激活，之后Ser¹²-Ser¹³位點自發磷酸化，稱為“自主激活”^［3］。只有自主激活的CaMKIV才能轉位至核內，參與基因轉錄的調控。此后，PP2A在細胞核內重新結合CaMKIV，并使活性環上的蘇氨酸殘基去磷酸化。這種無活性的CaMKIV從細胞核進入胞質，完成一次活性循環，稱為級聯反應^［4］。

1.3 介導的轉錄調節 在免疫系統中，細胞內CaMKIV大部分效應與這些轉錄因子的調節有關，包括cAMP-反應元件-結合蛋白（CREB）和它的輔激活因子CBP以及肌細胞增強因子2（MEF2）。CREB是一種遍在而保守的轉錄因子，可結合相同的cAMP效應元件（CRE），它的轉錄激活主要是通過S133位點的磷酸化來調節的，并使轉錄輔激活因子CBP募集。磷酸化的CREB-CBP復合物同基礎轉錄結構相互作用啟動RNA合成^［5］。MEF2存在于一些肌肉-特殊基因的啟動子中，最初被認為是肌形成的一個主要調節者。Blaeser等^［6］研究表明，CaMKIV介導的信號轉導至MEF2，能激活T細胞Nur77啟動子。在靜止胸腺細胞，MEF2募集一個家族的轉錄抑制物，包括Cabin1和組蛋白脫乙酰基酶（HDAC）-4、-5和-7。這些抑制物作為組蛋白脫乙酰基酶而改變染色質結構和沉默啟動子活性。Ca²⁺流入，Ca²⁺/CaM移走抑制物，使MEF2結合輔激活因子（如P300），進而啟動靶基因轉錄。

2 CaMKIV在T淋巴細胞中的作用

2.1 CaMKIV與T細胞發育 Krebs等^［7］研究顯示，CaMKIV在小鼠胸腺的胚胎發生過程中起調節作用。胚胎發育的前16 d CaMKIV存在于整個胸腺，第18天急劇增加，此時CaMKIV的水平與小狗出生后第一天的表達水平相當。對小鼠胚胎的原位雜交研究顯示，在發育12.5 d前CaMKIV mRNA在胸腺原基的外圍高表達，13.5 d后定位模式變得彌散，但在胸腺內可被檢測到，在胸腺發育的剩余時段則持續高表達，觀察到的信號與小狗出生后第一天的切片相當^［8］。CaMKIV在成熟胸腺亞型中的表達各不相同，在胸腺細胞從CD4^-CD8^-的第一階段（DN1）分化至DN3的過程中CaMKIV表達不斷增加，在DP（CD4⁺CD8⁺）T細胞中，CaMKIV水平與細胞表面TCRαβ的表達相關，在大部分成熟DP細胞和SP（CD4⁺或CD8⁺）細胞中表達逐漸減少^［7］。

Anderson等^［9］發現無活性的CaMKIV在胸腺細胞中表達使得胸腺體積增大，細胞構成增多，離體培養的存活率明顯下降。這種胸腺細胞在伊屋諾霉素和佛波酯十四烷酸刺激下不分泌IL-2及上調CD25的表達，原因可能與早期信號通路中CREB磷酸化顯著減少和早期快反應基因表達等相關。在這些動物中，觀察到SP細胞百分率緩慢下降，伴隨著DP細胞平行增加，表明CaMKIV在DP細胞轉化為SP細胞的過程中起作用。這個現象可能是胸腺細胞發育過程中CaMK級聯產生效應的外在表現，因此CaMKIV可能是DP細胞選擇發育中信號機制的一個主要成分。這個研究揭示CaMKIV在DP細胞選擇發育過程中的一種特殊作用，并且在形成成熟胸腺細胞T細胞受體（TCR）的所有組成成分的過程中也起特定作用。

2.2 CaMKIV與T細胞的活化 Hanissian等^［10］通過TCR觸發誘導Ca²⁺依賴和自發激活的CaMKIV快速增加，緊接著快速返回至基線，說明這激活和失活循環是簡短且受緊密調控的。Yu等^［11］在鼠EL4胸腺瘤細胞系中發現，CD3和CD28介導的信號通過一種與CaMKIV有關的機制促進CREB-CBP相互作用。在這個模型中CD28交聯激活CaMKIV，從而使CREB磷酸化和募集CBP。Park等^［12］提出，TCR刺激使CaMKIV的最大活化需要酶（包括CaMKK）的級聯。提供的直接證據就是克隆人和鼠CaMKKβ，并在Jurkat細胞的氨基酸T200中證明這種酶使CaMKIV磷酸化的能力，結果是CaMKIV的活性明顯增加。而且通過提高細胞內Ca²⁺含量CaMKKβ的活性也明顯增加。因此Park認為CaMKK的激活比CaMKIV更需要Ca²⁺的高濃度或者一個不同的Ca²⁺庫。對Ca²⁺的不同需求能使CaMKIV通過Ca²⁺/CaM單獨在某種環境有選擇的短暫的活化，或者通過被CaMKK磷酸化應答其它刺激信號而產生更強的激活。

IL-2對于初始T細胞的克隆擴增以及Treg細胞的增殖和存活都是非常重要的。IL-2基因的最大誘導需要可誘導轉錄因子AP-1。Ho等^［13］提出，CaMKIV通過一種涉及AP1的機制控制IL-2啟動子的活性，在成熟CD4⁺T細胞中起著控制CREB激活的作用。雖然在初始T細胞和胸腺細胞中，CaMKIV對于CREB的磷酸化和IL-2分泌的誘導都是可有可無的，但是在CD4記憶亞型T細胞的激活過程起著關鍵作用。Pan等^［14］發現MEF2在Jurkat細胞和一種鼠T細胞雜交瘤中調節IL2基因的轉錄。一個MEF2結合位點存在于IL2啟動子，接近TATA盒，這個元件在靜止性T細胞中被MEF2占有，起著調節Cabin1和組蛋白脫乙酰基酶（HDAC）-4募集的作用。從IL-2啟動子中移動MEF2位點或通過siRNA減少MEF2的表達，導致IL-2轉錄的明顯減弱。Pan等^［15］進一步研究發現，CaMKIV通過釋放Cabin1介導抑制MEF2介導的轉錄，進而調節IL-2啟動子中MEF2的轉錄活性。這是通過直接磷酸化Cabin1的C末端來為14-3-3產生一個停泊位點而實現的，14-3-3結合磷酰化Cabin1使核內Cabin1輸出，使MEF2發揮其轉錄激活功能。CaMKIV介導的Cabin1的核輸出可能是人T細胞激活過程所需要的一個重要部分。

3 CaMKIV與樹突狀細胞（DC）的存活

Illario等^［16］研究發現，在人單核衍生DC的分化過程中CaMKIV不斷蓄積，進而控制著CREB磷酸化和Bcl-2（凋亡調節蛋白家族，部分成員能抑制凋亡）蓄積。藥理抑制劑和無活性CaMKIV的異位表達，降低暴露在LPS中DC的生存能力。Camk4基因剔除小鼠的淋巴組織中DC數量減少，而且活體內脾臟暴露于LPS中不能蓄積成熟DC。雖然離體camk4^-/- DC能夠獲得成熟細胞的表現型，在LPS刺激下也能釋放常規量的細胞因子，但是它不能蓄積pCREB、Bcl-2和Bcl-xL，因此不能存活。CaMKIV剔除小鼠中轉基因表達Bcl-2，在LPS刺激時DC存活能力完全恢復。TLR激動劑促進DC存活主要是通過控制Bcl-2家族蛋白蓄積的時間，因此可以說Bcl-2是DC壽命和適應性免疫應答強度持續的“分子時鐘”^［17］。當離體的DC激活“Bcl-2分子時鐘”，發生自發凋亡時，TLR4轉導信號修正BcL-2的丟失，并且延長已活化的DC的壽命^［16］。

4 CaMKIV級聯反應在造血干細胞中的作用

Kitsos等^［18］研究顯示，CaMKIV在造血祖細胞及干細胞中表達，并且因為三種表面標記的狀態（c-Kit⁺，Sca-1⁺，Lin^-/low）而稱為KLS細胞。Camk4^-/-小鼠的骨髓中僅含少量的KLS細胞并且功能缺陷，血液中白細胞含量也下降。KLS細胞數量降低可能與凋亡增加有關，而KLS細胞中缺乏CaMKIV與CREB S¹³³位點磷酸化降低相關。Camk4^-/- KLS細胞中數目下降的還有CREB結合蛋白CBP，說明CaMKIV對于KLS細胞中CREB/CBP通路的激活很重要，Bcl-2被認為可能是CREB/CBP的一個下游靶點。在Camk4^-/-小鼠KLS細胞中，Bcl-2 mRNA和蛋白質下降，這在CaMKIV、磷酸化CREB、CBP和Bcl-2之間建立了一個清楚的關系。在Camk4^-/- KLS細胞中重新表達CaMKIV，能恢復磷酸化CREB、CBP及Bcl-2的表達水平。相似的，在Camk4^-/- KLS細胞中表達野生型CaMKIV，能糾正它們的增殖過度和凋亡異常。這些研究顯示CaMKIV在造血干細胞的維護中起著重要作用，也暗示在哺乳動物中阻斷這些酶可能有免疫抑制的作用^［2］。

5 問題與展望

綜上所述，這些有關CaMKIV的研究顯示，這條信號途徑廣泛參與免疫反應和炎癥應答的各級進程，與控制這些進程的分子機制密切相關。新近研究顯示，CaMKIV通過控制破骨細胞和樹突狀細胞的分化存活，介導骨骼與免疫系統之間的相互作用，與炎性骨疾病（類風濕性關節炎，牙周病和骨髓炎）的發生密切相關^［19］。抑制CaMKIV能抑制細胞因子的產生和輔刺激分子的表達，減緩有狼瘡傾向小鼠的疾病進程^［20］。Sugiyama等^［21］發現CaMKIV的異常調節是高糖導致的胰腺β細胞功能缺陷的重要因素，CaMKIV還參與exendin-4誘導的GLUT2及GK基因轉錄，進而影響胰島素的分泌^{［22，23］}。因此，在免疫細胞中關于CaMKIV的研究帶來引人入勝的前景，將為這些免疫炎性疾病的防治提供新的思路。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2011-02-24）

（本文編輯：陳丹云）