5-氮-2＇脫氧胞苷對急性粒細胞性白血病細胞系HL-60中CDH13基因甲基化的影響

作者單位：430040 武漢市東西湖區婦幼保健院（陶鈞宇）；武漢市兒童醫院（王艷麗）

通訊作者：陶鈞宇

【摘要】 目的 分析探討5-氮-2'脫氧胞苷對急性粒細胞性白血病細胞系HL-60中CDH13基因甲基化的影響。方法 5-Aza- dC處理培養的HL-60細胞，用甲基化特異性PCR（MSP） 法檢測處理前后細胞中CDH13基因的甲基化狀態，RT-PCR法檢測用藥前后細胞中CDH13 mRNA表達的變化。結果 HL-60中CDH13啟動子區發現甲基化，應用5-Aza-dC能使CDH13基因啟動子區CpG島去甲基化，而且經藥物處理后CDH13 mRNA的表達較前明顯增強。結論 5-Aza-dC能逆轉CDH13基因甲基化狀態，從而調控CDH13基因表達。

【關鍵詞】 5-氮-2'脫氧胞苷； CDH13； HL-60

急性粒細胞性白血病是小兒最常見的惡性腫瘤，其發病與基因的轉位、突變以及部分基因結構的改變密切相關^［1］。甲基化導致抑癌機制失活，影響急性粒細胞性白血病的發生、發展和復發。CDH13是一種抑癌基因，在急性粒細胞性白血病中它的表達下調^［2］。5-氮-2'-脫氧胞苷（5-Aza-dC） 是目前常用的一種甲基化抑制劑，能抑制抑癌基因的甲基化從而調節細胞的分化和基因表達。本研究應用5-Aza-dC干預培養的人急性粒細胞性白血病細胞系HL-60，觀察干預前后CDH13基因啟動子區甲基化狀態及表達水平，為急性粒細胞性白血病的藥物治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人急性粒細胞性白血病細胞系HL-60，5-Aza-CdR為美國Sigma公司產品，RNA提取試劑Transzol購自全式金公司，逆轉錄試劑盒購自美國Fermentas公司，甲基化修飾的試劑盒購于ZYMO RESEARCH公司，寡核苷酸引物由上海生工合成，Qia-gen Taq DNA聚合酶體系為德國Qiagen公司產品，紫外分光光度儀。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及修飾 用DNAiso Reagent抽提細胞株中高純度基因組DNA。紫外分光光度計測定核酸吸光度（ A）值及DNA濃度；按EZ DNA Methylation？ Kit 說明書進行操作，獲得10 μl TE緩沖液洗脫修飾好的DNA，-20 ℃保存。

1.2.2 RNA提取、逆轉錄 按全式金公司的說明書用Transzol提取細胞RNA。紫外分光光度儀檢測提取的總 RNA 的質量和濃度，要求A260/ A280≥2. 0，計算RNA 含量。取適量RNA進行逆轉錄合成cDNA，備后續實驗。

1.2.3 引物設計及PCR反應 CDH13上游：5'-TTCAGCAGAAAGTGTTCCATAT-3'；下游：5'-GTGCATGGACGAACAGAGT-3'。GAPDH上游：5'-ACAGTCCATGCCATCACTGCC-3'；下游：5'-GCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3'。95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃復性30 s， 72 ℃延伸30 s，共40個循環；72 ℃ 延伸5 min。RT-PCR產物經2%瓊脂糖膠分離。

1.3 統計學處理 干預前后比較采用配對t檢驗，Pearson統計方法分析基因甲基化與其表達之間的相關性，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

MSP法檢測5-Aza-dC作用前后HL-60細胞CDH13基因啟動子甲基化狀態改變，結果顯示，干預前HL-60細胞呈甲基化狀態，干預后去甲基化，見圖1、表1；5-Aza-dC作用前后HL-60細胞CDH13 mRNA表達水平，結果見圖2、表1。干預前后甲基化與HL-60細胞CDH13 mRNA表達水平呈負相關，r-0.96。

表1 干預前后甲基化與CDH13mRNA相對含量比較

3 討論

CDH13作為一種抑癌基因，具有很強的抗癌作用^［3］，現已證實在乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、結腸癌中CDH13表達下調^［4］。利用去甲基化制劑使已經發生甲基化的基因去甲基化后得以重新表達，恢復抑癌基因的功能，可能為臨床治療腫瘤提供新的手段。甲基轉移酶DNMT 的作用是催化DNA甲基化，在CpG島異常甲基化的腫瘤細胞中多呈過表達，5-Aza-dC正是通過抑制該酶的活性逆轉抑癌基因的甲基化，使之重新表達而發揮抑癌作用。

本研究用5-Aza-dC處理HL-60細胞后，發現5-Aza-dC處理前，HL-60細胞CDH13啟動子區高度甲基化，并且CDH13 mRNA呈低表達或者缺失；用5-Aza-CdR處理后，CDH13的啟動子區呈去甲基化，CDH13 mRNA的表達水平增加，兩者之間具有顯著的相關性。這提示在急性粒細胞性白血病癌細胞中，CDH13啟動子區的甲基化可能導致了CDH13的表達失活；去甲基化制劑5-Aza-dC能有效逆轉CDH13基因的甲基化狀態，激活CDH13基因表達。由于DNA異常甲基化往往出現在腫瘤的早期，這為急性粒細胞性白血病的早期診斷提供了一定的依據。5-Aza-dC可能為急性粒細胞性白血病的治療提供了一個新途徑。

參 考 文 獻

［1］ Frhling S， Scholl C， Gilliland DG， et al.Genetics of myeloid m alignancies: pathogenetic and clinical implications. J Clin Oncol， 2005，23（26）: 6285-6295.

［2］ Daskalakis M， Nguyen TT， Nguyen C， et al. Demethylation of a hypermethylated P15/INK4B gene in patients with myelodysplastic syndrome by 5-Aza-2'-deoxycytidine （decitabine） treatment. Blood， 2002，100（8）: 2957-2964.

［3］ Zhong Y， Delgado Y， Gomez J， et al. Loss of H-cadherin protein expression in human non-small cell lung cancer is associated with tumorigenicity. Clinical Cancer Research， 2001，7（6）:1683-1687.

［4］ Toyooka S， Toyooka KO， Harada K， et al. Aberrant methylation of the CDH13 （H-cadherin） promoter region in colorectal cancers and adenomas. Cancer Research， 2002，62（12）: 3382-3386.

（收稿日期：2011-03-21）

（本文編輯：陳丹云）·本刊資訊·

關于使用網上投稿的通知

為加快稿件處理速度、提高工作效率、節約成本，應廣大作者、專家的要求，從即日起所有投至本刊的稿件，請在郵寄投稿前登陸中國醫學創新網進行網上提交投稿，以縮短稿件刊出時間，便于作者隨時網上查詢稿件處理情況。投稿后請直接與雜志社電話聯系，以確認具體事宜。

詳情請登錄網站：http：//www.zgyxcx.com。

咨詢電話：010-63357546/63357548。