肝癌干細胞差異表達miRNA的篩選及鑒定

作者單位：224000 江蘇省鹽城市第一人民醫院

通訊作者：周廣軍

【摘要】 目的 培養卵圓細胞、肝癌干細胞樣細胞，篩選肝癌干細胞差異表達的microRNA并進行驗證。方法 體外分離培養卵圓細胞，肝癌干細胞樣細胞，通過microRNA芯片檢測差異表達的microRNA，對所得到的差異表達顯著的microRNA進行Northern驗證。結果 表達差異顯著的microRNA共有17個，經Northern雜交驗證，其中6個差異顯著的microRNA，發現hsa-let-7f-2、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-122在肝癌干細胞中的表達較卵圓細胞明顯升高。結論 hsa-let-7f-2、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-122在肝癌干細胞中的表達較卵圓細胞明顯升高，可以進一步驗證其在肝癌干細胞中的功能。

【關鍵詞】 miRNAs； 肝癌干細胞； 芯片譜

Screen and identification of differentially expressed miRNAs in liver cancer stem cells and oval cells ZHOU Guang-jun，SHI Kun，ZHA Wen-zhang，MU Xiang-ming. The Fist People's Hospital of Yancheng City， Yancheng 224000，China

【Abstract】 Objective To determine differentially expressed miRNAs of liver cancer stem cells and oval cells.Methods Liver cancer stem cells and oval cells were isolated from the livers of human cancer patients. The difference in miRNAs expression between liver cancer stem cells and oval cells was detected by both microarrays and Northern blot.Results Forteen miRNAs in liver cancer stem cells were expressed 1.5 fold above the levels in oval cells， three miRNAs in liver cancer stem cells were expressed 1.5 fold below the levels in oval cells. The expression of six selected miRNAs was further validated by Northern blot and three were confirmed.Conclusion The expression of a number of miRNAs in liver cancer stem cells and oval cells may suggest the potential roles of these miRNAs and applicability as diagnostic and prognostic signatures in liver cancer.

【Key words】 MicroRNAs; Liver cancer stem cells; Microarrays

腫瘤干細胞（tumor stem cells，TSC）是近年來實體腫瘤研究的熱點，對實體瘤認識產生了重大影響。肝癌、腦惡性腫瘤、乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤中都發現了TSC，并且其表面標記特征與生長特征等也得到一定闡述^［1］。TSC具備高度增殖能力與自我更新能力，也具備多向分化的潛能，是一種特殊類型的干細胞。TSC通過不均一分裂，一個TSC分裂形成一個新的TSC，和另一個可最終分化為包括腫瘤細胞在內的各種細胞的子細胞，其結果是維持TSC數目穩定并產生腫瘤。TSC的特性包括極強的致瘤能力與自我更新并多向分化，并且有高耐藥的特征。目前認為，TSC來源于正常成體干細胞^［1］。

肝癌是TSC研究的熱點之一。肝癌也越來越被設想為一種干細胞疾病。近年來，本課題組人員從大鼠肝癌中分離、培養并純化出一些有干細胞特性的細胞，有強的致瘤能力，與TSC比較接近，并且對這些細胞的增殖能力，轉移能力，細胞生長特征，細胞周期分析等生物學特征也進行了初步的研究^［2～4］。人們稱肝癌中的TSC為肝癌干細胞。

隨著miRNA研究的進展，人們發現某些miRNA在干細胞的自我更新的維持和哺乳動物早期發育起關鍵作用^［5］。本文采用miRNAs芯片技術和Northern印跡，篩選并鑒定肝癌干細胞中差異表達miRNA，可望為肝癌的基因治療提供全新的靶標和策略，為肝癌的發病機制和診斷治療研究提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 MEM培養基購自Hyclone，胰酶購自Sigma，胎牛血清為杭州四季青公司產品，瓊脂糖購自北京邦定生物公司，甲醛購自北京化工廠，美國臺盼藍染液購自華美生物工程有限公司，OV6、CKl9、自蛋白和甲胎蛋白抗體來自武漢博士德公司。硝酸纖維素膜購自Millipore公司。

1.2 實驗方法和步驟

1.2.1 肝癌手術標本選取 取3例肝癌患者手術后標本進行實驗。

1.2.2 卵圓細胞培養、分離與鑒定 取標本中肝臟正常組織，組織塊法分離、培養大鼠卵圓細胞。鑒定方法：（1）測定細胞的大小及形態學觀察；（2）免疫細胞熒光鑒定，抗體包括OV6、CKl9、自蛋白和甲胎蛋白等。

1.2.3 肝癌干細胞樣細胞培養、分離與鑒定 取處于對數生長期的肝癌細胞，有限稀釋法單克隆分離、培養肝癌干細胞；裸鼠成瘤實驗驗證其成瘤能力后，觀察高成瘤能力，有分化能力的腫瘤細胞即為肝癌干細胞樣細胞。

1.2.4 測量肝癌干細胞及卵圓細胞microRNA表達譜并進行驗證 取上面培養中的肝癌干細胞及卵圓細胞，利用microRNA芯片比較兩種細胞表達microRNA差異情況。microRNA芯片采用博奧生物有限公司的產品，該芯片含人類238個microRNA，包括目前已經研究成熟的絕大部分microRNA。根據不同個體表達microRNA差異情況，找出肝癌干細胞相對穩定表達的特征microRNA，如果篩選后特征microRNA仍然較多，適當增加樣本量進行實驗。Northern blot進一步驗證特征microRNA。

1.2.5 Northern印跡 1.75%瓊脂糖煮沸溶解，冷卻到60 ℃，加7 ml 10×MSE緩沖液、11.5 ml甲醛，加水定容至70 ml，混勻后倒入盛膠槽。等膠凝固后，去掉梳子和膠布，將盛膠槽放入1×MSE緩沖液的電泳槽。使RNA變性，RNA 4.5 ml，10×MSE緩沖液20 ml、甲醛3.5 ml，去離子甲酰胺10 ml。55 ℃加熱15 min，冰浴冷卻。加2 ml 5×載樣緩沖液，上樣，同時加RNA標記物。60伏電泳過夜。取出凝膠，水中浸泡2次，每次5 min。室溫下將膠浸到50 mmol/L NaOH和10 mmol/L NaCl中45 min，水解高分子RNA，以增強轉印。室溫下將膠浸到0.1 mmol/L Tris HCl（pH7.5）中45 min，使膠中和。20×SSC洗膠1 h。20×SSC中過夜轉印到硝酸纖維素膜上。取出硝酸纖維素膜，80 ℃真空烘烤2 h。

1.3 統計學分析 各分組所得計量數據采用均數±標準差（x±s）表示，用Prism 5軟件處理數據，兩組間均數比較用t檢驗。檢驗水準α0.05。

2 結果

2.1 RNA提取及質量鑒定結果 Trizol一步法提取細胞中的總RNA，通過異丙醇沉淀法濃縮RNA，用分光光度計定量，樣品總RNA的OD260/OD280值在1.8～2.0之間。甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳結果顯示條帶清晰，28S∶18S RNA條帶亮度接近2∶1，RNA完好無降解，質量符合miRNAs芯片的質量要求（見表1）。

表1 RNA濃度和純度測定

2.2 肝癌干細胞和卵圓細胞差異表達miRNAs芯片數據分析 提取卵圓細胞和肝癌干細胞的總RNA，利用microRNA芯片比較兩種細胞表達miRNA差異情況。此芯片共包括人類238個microRNA，包括目前已經研究成熟的絕大部分microRNA。根據數據中上下調1.5倍篩選得到肝癌干細胞較卵圓細胞表達上調的miRNA共有14個，下調的miRNA有3個，最高表達變化達7倍。表達差異顯著的miRNA共有17個。具有顯著統計學差異的17種miRNA中，has-miR Plus屬于尚未被miRBase數據庫所記錄，暫不列入研究范圍；SV40-miR及hsv1-miR為病毒性miRNA也不列入研究范圍。

2.3 Northern分析 為了排除由于miRNA在芯片雜交前進行擴增實驗所造成的假陽性，筆者選擇了6個miRNAs進行Northern雜交給予驗證。包括5個高表達的miRNAs：miR-520h、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-122、miR-365、hsa-let-7f-2^*和1個低表達的miRNA：miR-129。結果表明，與卵圓細胞相比較，肝癌干細胞中hsa-let-7f-2表達升高約5倍，hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-122表達升高約6倍，與芯片結果符合率為50%（圖1）。其中hsa-let-7f-2被證明與干細胞關系密切，hsa-miR-122、hsa-miR-199a-3p與肝癌關系密切。

注：采用Northern印跡技術對芯片篩選出的表達有顯著差異的miRNA進行驗證，發現hsa-let-7f-2（a）、hsa-miR-199a-3p（b）、hsa-miR-122（c）在肝癌干細胞中的表達較卵圓細胞明顯升高，^**P<0.01

3 討論

現在出現了大量的對于細胞中miRNA的研究，這些研究關注于其在細胞發育分化中的差異表達。目前人們主要認為在細胞分化發育的不同時期，miRNA都可能存在著特異性的表達。而這些特異性的表達，可能對于干細胞的分化和復制起著至關重要的作用^［6～8］。但微小RNA在肝癌干細胞中的作用尚無報道。作為機體內源性RNA，miRNA很可能在肝癌起到重要的調控作用。在研究中，人們對人ESC細胞中的36種miRNA進行了文庫性的克隆，之后研究了這些miRNA的表達情況。結果發現其中一些miRNA會在ESC細胞中特異性出現，其基因表達量在細胞發育的過程中會逐漸下降。這些結果表明了，miRNA對于哺乳動物多能干細胞的發育起到了至關重要的作用。此外，之前的研究還發現這些miRNA具有高度的保守型^［9］。對于干細胞的自我更新和未分化狀態的維持具有重要意義，可作為胚胎發育早期和未分化干細胞的分子標記物。miRNAs對干細胞的繼續分化增殖也具有顯著的調節作用。在干細胞分化發育的過程中，miRNA的表達會出現變化，而這種變化可以下調細胞內阻止干細胞分化的基因，此外，miRNA還可以激活一些特定的基因，這些基因可以決定干細胞發育后的分化方向^［10］。另外，miRNAs也可以起到癌基因或調節癌基因表達的作用。miRNAs控制了細胞的生長、分化和凋亡，因此，這些miRNAs表達的失調與腫瘤發生有關^{［11～13］}。

本研究采用miRNA芯片技術發現肝癌干細胞和卵圓細胞表達差異顯著的miRNA共有17個，經Northern雜交驗證其中6個差異顯著的miRNA，發現hsa-let-7f-2、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-122在肝癌干細胞中的表達較卵圓細胞明顯升高。為進一步研究miRNAs在肝癌干細胞過程中分子機制的調控作用提供了有用的信息，為進一步研究miRNAs在肝癌發生發展過程中的功能奠定基礎，對篩選出的差異miRNAs進行功能學的研究則有待進一步的深入探討。

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（收稿日期：2011-03-23）

（本文編輯：車艷）