rRNA擴增直接檢測艾滋和結核共感染的結核分枝桿菌的初步研究

作者單位：650041 昆明市第三人民醫院

通訊作者：汪亞玲

【摘要】 目的 建立一種快速、準確、簡便的檢測結核分枝桿菌的方法。方法 應用間接轉錄擴增技術，以結核分枝桿菌特異性rRNA為擴增目標，擴增片段被特異性DNA探針結合（雜交），再經雜交保護分析法篩選，最后以化學發光儀檢測被標記的rRNA。用該法檢測62例臨床標本。結果 62 例艾滋合并結核患者痰標本檢出陽性9例。結論 rRNA擴增直接檢測結核分枝桿菌方法作為結核病診斷的一項新的分子生物學檢測方法，具有重要的臨床應用價值。

【關鍵詞】 結核分枝桿菌； rRNA

近年來，結核病已經成為艾滋病患者主要機會性感染，HIV 和結核分枝桿菌（MTB）雙重感染年遞增率為10%，其發生結核病的概率HIV 陰性者比MTB陽性者高30倍^［1］。合并感染后，病情進展迅速，是致死的主要原因。全球每年有400萬人死于HIV和結核的雙重感染，艾滋病合并結核的流行較為嚴重。但由于艾滋病患者合并結核感染固有的特點，給診斷及治療帶來很大困難。為滿足臨床迫切需要一種更快、更準確地早期診斷結核病的方法，以保證及早、更合理地進行治療，本研究引進了美國Gen-Probe公司rRNA擴增結核分枝桿菌直接檢測（MTD）技術^［2］，首次在國內應用于HIV/AIDS合并結核分枝桿菌感染患者中結核桿菌的檢測，并與傳統的涂片抗酸染色和TB-PCR法、BACTEC MGIT960培養法進行平行觀察，以比較其優劣，探討該法的臨床應用價值。

1 材料和方法

1.1 樣本來源及分組 本研究分析的均為臨床確診病例。主要選擇2009年5月～2010年6月本院感染科住院的62例艾滋病患者的痰標本，男47例，女15例；年齡11～73歲，平均41歲，HIV感染診斷標準參照2005年我國衛生部發布的《艾滋病診療指南》診斷標準。

1.2 主要儀器及試劑 水浴超聲儀、95 ℃干浴儀、42 ℃干浴儀、60 ℃干浴儀及LEADER 50 化學發光檢測儀等均為美國Gen-Probe公司商品。MTD試劑盒、檢測試劑和陽、陰性質控物等均為美國Gen-Probe公司商品。

1.3 MTD操作方法 痰標本中加入3% N-乙酰-L-半胱胺酸-氫氧化鈉（NALC-NaOH） （1：325），用振蕩器振蕩消化15 min；將痰液轉入50 ml離心管，加pH 6.8磷酸鹽緩沖液（ PBS）至45 ml刻度；3000 g離心15 min；沉淀物加pH 6.8 PBS 1 ml待用。

1.4 rRNA擴增MTD 嚴格按MTD試劑盒說明書的要求進行操作，其主要反應步驟:（1）裂解細菌釋放Rrna:500μl前處理沉淀物懸液加入裂解管，于水浴超聲儀中超聲15 min。（2）溶解產物:樣品裂解產物、陽、陰性質控物各25 μl分別加入預置有擴增試劑50 μl及甘油200 μl的擴增管；于95 ℃干浴儀中15 min。（3）擴增：各擴增管于42 ℃干浴儀中預溫5 min后，加入25 μl酶試劑混勻后繼續擴增30 min。（4）雜交：各管加入100 μl雜交試劑混勻后，于60 ℃干浴儀中15 min。（5）篩選：各管加入300 μl篩選試劑混勻后于60 ℃干浴儀中15 min，取出置室溫5 min后檢測。（6）檢測：用LEADER 50 min化學發光檢測儀檢測樣品光值（RLU），樣品被檢測的同時rRNA也被淬滅。（7）結果判斷：臨界值：30 000 RLU； RLU≥30 000陽性，<30 000為陰性；要求同批檢測的陽性質控RLU>500 000，陰性質控RLU<20 000，方可報告。

1.5 其他平行檢測方法 每份樣品的前處理沉淀物均以常規方法平行作涂片抗酸染色、BACTEC MGIT960培養法和實時熒光定量PCR（TB-DNA），TB PCR 熒光檢測試劑盒，TB 陽性定量參考品，購于中山大學達安基因股份有限公司；DA7600 型實時熒光定量PCR 儀為中山大學達安基因股份有限公司生產。

2 結果

45例HIV感染者MTD、涂片、TB-PCR和培養法的平行檢測 結果見表1～3。

表1 62例HIV感染者MTD和涂片的平行檢測結果

表2 62例HIV感染者MTD和TB PCR的平行檢測結果

表3 62例HIV感染者MTD和培養法的平行檢測結果

3 討論

目前，我國已進入艾滋病快速增長期，同時我國也是全球結核病高負擔國家之一。結核病是艾滋病最常見的最先發生的機會性感染之一。艾滋病合并結核病感染已成為嚴重的公共衛生問題，WHO 認為艾滋病和結核病不應再被看作兩個獨立的疾病。結核菌感染后，主要的病理及臨床表現為結核桿菌引起的免疫反應。艾滋病患者由于免疫損害，臨床表現不典型，影像學表現不典型，且肺外結核多見，導致臨床診斷困難。由于艾滋病的特殊性，其結核病原檢測較難，目前臨床常用的病原診斷方法中，結核菌素及痰涂片常常陰性，傳統的結核培養診斷慢，導致無病原依據確診，下一步的治療不規范。MTD系統的基本原理，是應用間接轉錄擴增技術，以結核分枝桿菌特異性rRNA為擴增目標，擴增片段被特異性DNA探針結合（雜交），再經雜交保護分析法篩選，最后以化學發光儀檢測被標記的rRNA。由于rRNA僅存在于活的生物體內，故MTD 陽性具有結核分枝桿菌活菌診斷價值。由于rRNA為單鏈結構，脆弱易降解，故不易造成環境污染。相比之下，DNA為雙鏈結構，穩定、不易降解，容易造成環境污染及假陽性結果。細菌rRNA片段的含量是DNA片段的數百至數千倍，同一樣品擴增rRNA的靈敏度將大大提高。

62例艾滋患者臨床標本， MTD檢出陽性9例，陽性率14.5%，高于痰涂片鏡檢的9.6%，由于巨噬細胞內的抗酸桿菌抗酸性減弱或消失，致使抗酸染色不易檢出。其中有1例痰涂陽性而MTD陰性，可能為死菌或非結核分枝桿菌，因為rRNA是核糖體內遺傳物質，為活菌標志，而核糖體是第一個伴隨細菌活力消失而降解的結構。另有1例TB-DNA陽性而MTD陰性，可能是由于PCR方法對活菌和死菌的DNA都可以進行擴增，而MTD只能對活菌進行檢測，這就導致患者痰樣本MTD陰性而PCR 試驗卻是陽性結果。從表3顯示，MTD檢出陽性9例，陽性率14.5%，低于培養法的16.1%，可能是由于艾滋病患者免疫力低下，易感染其它分枝桿菌，而MTD只能檢出結核分枝桿菌。為了診斷非結核分枝桿菌，建議與培養進行平行檢測。另據有關研究報道， MTD 在支氣管灌洗液中的陽性檢出率明顯高于在痰液中的陽性檢出率^［3］，建議不能排痰或排痰困難的艾滋病患者可經纖支鏡刷檢，取支氣管灌洗液進行MTD檢測，可獲較滿意的效果。筆者將進一步改進實驗方法，優化實驗條件，從而提高陽性檢出率。

總之，MTD作為結核病診斷的一項新的分子生物學檢測方法，能幫助臨床綜合判斷，為臨床提供診斷和治療的依據，具有重要的臨床應用價值。

參考文獻

［1］ 李拯民.艾滋病和結核病.臨床肺科雜志，2005，10（2）:134-135.

［2］ Fredy G，Gregorio F，Eduardo P，et al.Comparative evaluation of new versions of the Gen-Probe amp lified Mycobacterium Tuberculosis Direct test for direct detection of Mycobacterium tuberculosis inrespiratory and nonresp iratory specimens.J ClinMicrobiol，1998，36:684-689.

［3］ 王易偉.rRNA擴增直接檢測結核分枝桿菌的臨床應用價值探討.中華檢驗醫學雜志，2005，5 （ 28）:543-544.

（收稿日期：2011-04-29）

（本文編輯：陳丹云）