熒光染料CM-DiI標記大鼠骨髓間充質干細胞的體外實驗

【摘要】 目的 探討熒光染料CM-DiI標記大鼠骨髓間充質干細胞的效果及其對細胞活力、增殖能力、凋亡等生物學特性的影響。方法 用梯度離心加貼壁培養法獲取、培養、擴增大鼠骨髓間充質干細胞。取第4代MSCs，分為實驗組和對照組，用濃度為6 μmol/L的CM-DiI對實驗組MSCs進行標記。用臺盼藍染色檢測細胞的活力，CCK-8法檢測細胞增殖能力，Hoechst 33258染色法檢測細胞凋亡。細胞標記后用倒置相差熒光顯微鏡動態觀察不同子代MSCs的陽性標記率、熒光衰減情況及細胞生長、形態變化。結果 CM-DiI標記后的MSCs發橙紅色熒光，高倍鏡下顯示細胞上有密集排列明亮熒光顆粒。CM-DiI標記后1 d、4 d、8 d、16 d、24 d細胞標記陽性率分別為100%、（85.2±4.9）%、（42.3±5.1）%、（17.6±3.6）%、（4.4±1.3）%，細胞標記陽性率和熒光強度隨傳代次數和培養時間的增加而呈顯著進行性下降。標記細胞的大小、形態、活力、增殖能力、細胞凋亡與未標記細胞相比無明顯差異。結論 CM-DiI標記骨髓間充質干細胞簡便、有效，對其生物學特性無明顯影響，可用于MSCs的短期示蹤。

【關鍵詞】 骨髓間充質干細胞； CM-DiI； 標記

In vitro study of rat mesenchymal stem cells labeled with fluorescent dye CM-DiI CHEN Guo-dong，ZHU Dong-liang，TAN Li.The First People's Hospital of Guangzhou，Guangzhou 510180，China

【Abstract】 Objective To evaluate the efficiency of lipophilic fluorescent dye CM-DiI on labeling mesenchymal stem cells（MSCs） of rat，and the effect on cell viability，proliferation and apoptosis. Methods The MSCs cells were isolated from bone marrow of SD rat by density gradient centrifugation，and amplificated using adherent culture.The fourth generation MSCs were divided into control group and experimental group.Cells of experimental group were stainted with 6 μmol/L CM-DiI concentrations.Cell viability and proliferation was measured by the exclusion of trypan blue dye and Cell Counting Kit-8（CCK-8） assay.Hoechst 33258 staining were used to determine cell apoptosis.The percentage of positively labeled cells，dicrease of fluorescent intensity，morphologic change of MSCs was dynamic observed by inverted phased fluorescence microscope.Results Using fluorescent microscopy，CM-DiI-positive cells showed strong orange-red fluorescence，and intensive fluorescent particles was observed within the CM-DiI-labeled cells.The percentage of CM-DiI-positive cells was 100%、（85.2±4.9）%，（42.3±5.1）%，（17.6±3.6）% and （4.4±1.3）%，after day 1，4，8，16 and 24，respectively.The percentage of CM-DiI-positive cells and the fluorescence intensity decreased roughly in parallel with the number of cell divisions and the time of culture.The CM-DiI did not affect cell viability，proliferation and apoptosis.Conclusion CM-DiI labeling was convenient and effective，did not affect biological characteristics of MSCs，it should be a useful marker for tracking cells in short-term experiment.

【Key words】 Mesenchymal stem cells； CM-DiI； Labeling

干細胞移植是細胞治療的重要內容，是當前再生醫學研究的熱點。骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是來源于骨髓的一種成體干細胞，具有自我更新和多向分化潛能，在適當條件下可分化為肝細胞樣細胞、成骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞、血管內皮細胞等^［1～3］。移植前對干細胞進行有效標記是移植后檢測、識別移植細胞，了解移植細胞在體內存活、遷移、分布、分化、轉歸和判斷療效的必要前提。CM-DiI是1，1'-雙十八烷-3，3，3'，3'-四甲基吲哚羰基花青高氯酸鹽（1，1'-dioctadecyl-3，3，3'，3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，DiI）的衍生物，與DiI一樣是具有親脂性的熒光染料，可對細胞進行非特異性染色。當DiI嵌入細胞膜后在549 nm激發光下，細胞可發射波長為565 nm橙紅色熒光，便于熒光顯微鏡下觀察、辨識移植細胞。DiI類染料標記細胞方法較簡便、安全，可用于多種培養細胞的標記^［4～6］。本文擬對CM-DiI標記MSCs的方法、效果，及其對MSCs細胞活性、增殖能力、凋亡等生物學特性的影響進行探討，為MSCs的標記和示蹤提供有用的信息。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實驗動物 4周齡SPF級雄性（sprague Dawley，SD）大鼠1只，體重約70 g，由中山大學中山醫學院實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑和儀器 胎牛血清（澳大利亞PAA公司），低糖型DMEM培養基（美國GIBCO公司），Percoll細胞分離液（美國Pharmacia公司），Hoechst 33258（美國Molecular probe公司），CCK-8試劑盒（日本同仁化學研究所），CM-DiI（美國Molecular probe公司），CO₂培養箱（美國Thermo公司），超凈工作臺（蘇州凈化設備廠），BECKMAN COULTER高速冷凍離心機（美國BECKMAN公司），倒置熒光相差顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠骨髓間充質干細胞的獲取、培養和擴增 無菌條件下分離大鼠股骨和脛骨，用生理鹽沖洗骨髓腔，獲取細胞懸液，2000 rpm離心15 min，棄上清及脂肪層。生理鹽水重懸，加入比重為1.077 g/ml的Perco ll分離液，2000 rpm離心20 min，收集中間層的單個核細胞，生理鹽水重懸，1000 rpm離心10 min，棄上清，將細胞用完全培養基（低糖DMEM，10%胎牛血清，10 ng/ml EGF）混懸，種植于100 mm塑料培養皿中，放入37 ℃，5% CO₂、飽和濕度的培養箱中培養。24 h后首次換液，此后每3 d換液一次，待細胞長到90%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化液進行傳代。

1.2.2 骨髓間充質干細胞的熒光標記 取第4代MSCs用0.25%胰蛋白酶消化，離心收集細胞后加入PBS制成細胞懸液，用計數板計數，再將細胞平均分為實驗組和對照組（每組2個復孔）。實驗組按1×10^{6>/sup>細胞量加入6 μl的CM-DiI，37 ℃孵育5 min，4 ℃冰箱內置15 min，以PBS洗滌、重懸2次，加入10%DMEM培養基中置于37 ℃、5%的CO₂培養箱內培養。每天用倒置熒光相差顯微鏡（CM-DiI的熒光激發波長為549 nm）觀察細胞生長、形態和熒光強度變化。標記后每4 d按1：2比例傳代1次，標記后24 h和每次傳代前于100×顯微鏡下隨機取3個視野對陽性和陰性標記細胞進行觀察、拍照和計數（700個以上細胞），并計算細胞陽性標記率，觀察期為24 d。}

1.2.3 臺盼藍染色檢測細胞活力 收集實驗組和對照組細胞制成密度為1×10^{6>/sup>/ml細胞懸液，取90 μl的細胞懸液和10 μl的0.4%臺盼藍混勻，在3 min內，直接鏡下用細胞計數板對活細胞（細胞膜完整，拒染臺盼藍）和死細胞（細胞膜完整性喪失，被染成藍色）計數，并計算臺盼藍拒染率（即細胞存活率），公式如下：細胞存活率＝（細胞總數－藍染細胞數）/細胞總數×100%。}

1.2.4 細胞凋亡檢測 取實驗組和對照組MSCs以0.5×105的數量接種于24孔培養板上，24 h后加入Hoechst 33258（5 μg/ml）對MSCs進行染色。熒光倒置顯微鏡下觀察、拍照并計數。判斷標準：正常細胞核均勻淺染，凋亡細胞核固縮、深染。細胞凋亡率＝凋亡細胞總數/細胞總數×100%。

1.2.5 CCK-8法檢測骨髓間充質干細胞的細胞增殖能力 將標記細胞和未標記細胞以每孔5×103的數量接種于96孔培養板上（每孔培養基量為200 μl），標記組和未標記組各設4個復孔，設加培養基孔空白孔為陰性對照。接種后放入培養箱中培養，48 h、72 h各換液1次，第1，3，5，7天各取一板細胞行細胞增殖測定。檢測前向各實驗孔和對照孔加入CCK-8液20 μl，培養箱內孵育2 h，用酶聯免疫檢測儀于450 nm波長測定各孔吸光度值，以空白孔調零后求出各組平均值。

1.3 數據統計和結果分析 采用SPSS 11.5軟件包進行統計分析，數據用（x±s）表示，組間比較用t檢驗，率的比較用χ^{2>/sup>檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。}

2 結果

2.1 骨髓間充質干細胞的體外培養 梯度離心加貼壁培養法獲取的MSCs培養24 h后首次換液可見散在貼壁單個核細胞，多呈短梭狀和多角形。48 h后貼壁細胞開始分裂增生，細胞形態不一，可為三角形、多角形、梭形或星芒狀，出現散在集群狀生長細胞克隆，其后細胞生長速度逐漸加快，并從克隆集群向周邊貼壁爬行、生長（以1周后為明顯），12 d后細胞達90%融合，MSCs細胞排列成魚群狀或旋渦狀，細胞多呈長梭形或多角形。

2.2 CM-DiI標記骨髓間充質干細胞后細胞形態變化和熒光的動態觀察 標記后的MSCs在倒置熒光相差顯微鏡下（激發波長為549 nm）發明亮橙紅色熒光，細胞核在熒光襯托下對比明顯的呈類圓形暗區，高倍鏡下顯示MSCs細胞上有密集排列明亮熒光顆粒，細胞形態、大小無明顯變化，細胞核無染色。細胞標記后1、4、8、16、24天細胞標記陽性率分別為100%、（85.2±4.9）%、（42.3±5.1）%、（17.6±3.6）%、（4.4±1.3）%，熒光強度以染色24 h后最明顯。細胞陽性標記率和熒光強度均隨傳代次數和培養時間的增加而呈快速進行性下降。

2.3 骨髓間充質干細胞CM-DiI標記后細胞的活力、凋亡和增殖能力 臺盼藍染色示標記細胞與未標記細胞的臺盼藍拒染率分別為（94.5±1.8）%和（95.3±2.2）%，無顯著性差異（P>0.05）。Hoechst 33258檢測貼壁后標記細胞凋亡率為（5.3±1.6）%，未標記細胞為（5.8±1.3）%，兩者相比無顯著性差異（P>0.05）。CCK-8法檢測細胞增殖能力示標記細胞生長、增殖狀態良好，其1 d，3 d，5 d，7 d的吸光度值與未標記組相比，差異無顯著性意義（P>0.05）。見表1。

表1 CCK-8法檢測細胞增殖能力（x±s ）

3 討論

干細胞的常用標記方法有轉基因標記（熒光蛋白、β-半乳糖苷酶等）、性染色體標記（Y染色體）、熒光染料標記（DiI、DAPI、Hoechst33258等）、核素標記（3 H-TdR、BrdU等）、磁標記（SPIO、USPIO等），這些標記方法各有其優缺點^{［2～4，6］}。DiI屬于細胞膜熒光染料，可用于細胞膜標記，檢測細胞的融合、黏附和遷移，與其它標記方法相比，有操作較簡便、無放射性、無明顯細胞毒性、不改變細胞基因和表型、移植后不誘發免疫反應等優點，可用于神經細胞、淋巴細胞、肝細胞、人和大鼠的成體干細胞等多種細胞的體外和體內的標記示蹤，特別適用于自體移植細胞標記^{［4～5，7，8］}。

CM-DiI是DiI的衍生物，與DiI等其它同類熒光染色相比，因具有一定的水溶性，且含有氯甲基化活性巰基部分，使其更易嵌入、彌散并穩固地結合到整個細胞膜上，使染色更快捷、均勻、持久^［3，8］。文獻報到，CM-DiI標記濃度一般為1～25 μmol/L，最常用的濃度為4～10 μmol/L，如用50 μmol/L濃度可將染色時間縮短至2 min，但濃度過高則可能影響細胞功能^［8，9］。本實驗用6 μmol/L的CM-DiI對梯度離心和貼壁培養法獲得的第4代SD大鼠MSCs進行標記，標記過程耗時約30 min；CM-DiI標記后倒置相差熒光顯微鏡下觀察標記細胞發橙紅色明亮熒光，標記陽性率達到100%，未標記細胞則無熒光，極易辨識；可見CM-DiI標記是一種快捷、簡便、有效的MSCs標記方法。標記后動態觀24 d，實驗組MSCs細胞的大小、形態與對照組細胞相比無明顯變化；且臺盼藍染色、Hoechst 33258染色、細胞毒性實驗（即細胞增殖實驗，用CCK-8法），均顯示6 μmol/L的CM-DiI標記濃度對SD大鼠MSCs無明顯細胞毒性、不增加細胞凋亡、不影響細胞生長增殖能力，證明CM-DiI標記是一種安全的MSCs標記方法。

由于熒光染料會出現自發性淬滅，而且CM-DiI標記細胞在細胞分裂后熒光成份平均分配至子代細胞中，故細胞陽性標記率、熒光強度會隨培養時間和傳代次數的增加而出現進行性下降^［9］。本實驗顯示CM-DiI標記1 d時細胞熒光強度達峰值，細胞標記陽性率達100%，但4 d后細胞標記陽性率即降到約85%，鏡下觀察細胞熒光強度有所衰減；經1次傳代并培養至8 d時，細胞標記陽性率即降到約50%以下，細胞熒光強度亦明顯減弱；培養24 d并6次傳代后熒光強度已急劇衰減，僅有約4%的細胞有可探查熒光；以上證據表明，CM-DiI標記較適合于干細胞的短期標記和示蹤。

參 考 文 獻

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