阻斷Notch信號(hào)通路治療多發(fā)性骨髓瘤的研究進(jìn)展

【摘要】 Notch在多個(gè)物種中均有表達(dá)，其家族成員的結(jié)構(gòu)具有高度保守性，Notch信號(hào)通路更是在眾多病理生理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Notch家族成員Notch1不僅全程參與正常MM細(xì)胞的發(fā)育，同時(shí)也與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生密切相關(guān)。Notch信號(hào)通路激活后可通過(guò)對(duì)NF-κB、C-myc的相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖，促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而抑制骨髓瘤細(xì)胞的凋亡，它與骨髓瘤的發(fā)生和耐藥有關(guān)。通過(guò)對(duì)Notch及其通路的研究，使得對(duì)MM的發(fā)病機(jī)制有了更深入的了解，從而為MM的診治提供了新靶點(diǎn)。一些阻斷Notch信號(hào)的藥物如砷劑及γ-分泌酶抑制劑等應(yīng)用使MM的治療得到了極大的突破。本文就該領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀進(jìn)展進(jìn)行綜述。

【關(guān)鍵詞】 多發(fā)性骨髓瘤； Notch信號(hào)通路； γ-分泌酶抑制劑

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多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是來(lái)源于終末分化的B淋巴細(xì)胞的惡性腫瘤，其特征是骨髓中漿細(xì)胞克隆性增生、合成和分泌大量免疫球蛋白。臨床有骨痛、溶骨性損害、貧血、腎功能不全、高鈣血癥等表現(xiàn)。MM發(fā)生發(fā)展與骨髓瘤細(xì)胞的異常增殖和微環(huán)境血管生成密切相關(guān)。

1 Notch信號(hào)通路

Notch信號(hào)通路是介導(dǎo)細(xì)胞和細(xì)胞之間直接接觸的主要信號(hào)通路之一，其受體和配體都是膜結(jié)合蛋白。Notch信號(hào)蛋白于1916年被Morgan等人首次發(fā)現(xiàn)，因其部分喪失功能的突變體將在果蠅翅膀的邊緣造成缺口（Notch）而得名^［1］。Notch信號(hào)不僅影響著胚胎的發(fā)育及干細(xì)胞的增殖、分化，而且與免疫系統(tǒng)功能調(diào)控、胰腺癌及髓母細(xì)胞瘤等腫瘤發(fā)生密切相關(guān)^［2］。一個(gè)完整的Notch信號(hào)通路包括Notch受體、配體、CSL蛋白、Hes基因及Notch的調(diào)節(jié)分子等。

1.1 Notch的受體 在哺乳動(dòng)物中共發(fā)現(xiàn)4類 Notch基因，分別定位于染色體9q34、1p13-p11、19p13.2-p13.1和6p21.3，編碼4種Notch受體，分別為Notch1-4。Notch受體是一種跨膜受體，細(xì)胞外的結(jié)構(gòu)域包含29~36個(gè)串聯(lián)的表皮生長(zhǎng)因子樣重復(fù)序列(epidermal growth factor，EGF)及3個(gè)富含半胱氨酸的Lin/Notch重復(fù)序列(Lin/Notch repeats，LNR)，參與配體DSL的結(jié)合及Notch活化。在LNR與跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain，TM)之間保守的半胱氨酸可能參與受體異二聚體化時(shí)的二硫鍵結(jié)合。Notch受體的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Notch intracellular domain，Notch IC)由RAM結(jié)構(gòu)域、6個(gè)cdc10/ankyrin(ANK)重復(fù)序列、2個(gè)核定位信號(hào)(NLS)和PEST結(jié)構(gòu)域（proline-glutamate-serine-threonine-rich domain)組成(Notch4只有1個(gè)NLS)。NICD是Notch受體蛋白的活性形式，其中RAM結(jié)構(gòu)域是C啟動(dòng)子結(jié)合因子-l/重組信號(hào)結(jié)合蛋白-Jκ(C promoter binding factor-1/Recombination signal binding protein-J kappa，CBFl/RBPJκ)的主要結(jié)合部位，CBF1是存著于人或哺乳動(dòng)物中的Su(H)蛋白的同源蛋白，也能與ANK重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域相互作用；ANK重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域也是Deltex、Mastermind等蛋白的結(jié)合部位，這些蛋白對(duì)Notch信號(hào)通路有調(diào)節(jié)作用。

1.2 Notch的配體 Notch配體包括果蠅中的Delta和Serrate及秀麗隱桿線蟲(chóng)的Lag-2和Apx-1，取Delta、Serrate和Lag-2的首字母，又被稱為DSL蛋白。在哺乳動(dòng)物中證實(shí)有兩個(gè)Notch配體家族，分別是Delta和Serrate/Jagged，在Delt家族中包括小鼠的Delta-like1、3，Serrate/Jagged家族中包括小鼠和人類的 Jagged-1、2。與Notch相似，它們也是跨膜蛋白，胞外區(qū)包含數(shù)量不等的EGF-R結(jié)構(gòu)域和DSL結(jié)構(gòu)域。DSL結(jié)構(gòu)域在配體家族中高度保守，是與Notch結(jié)合并激活Notch所必需的。目前發(fā)現(xiàn)的人DSL蛋白包括Jagged-1、Jagged-2、Delta-1、Delta-3和Delta-4。

2 Notch信號(hào)通路傳導(dǎo)途徑

Notch蛋白合成后，在高爾基體被Furin樣轉(zhuǎn)化酶首次切割為2個(gè)片斷，酶切形成的ECN(Extracellular Notch subunit)和NTM(Notch Transmembrane subunit)形成異二聚體形式的成熟Notch受體，轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面。Notch受體蛋白包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，胞外區(qū)是結(jié)合配體并激活受體的部位。Notch受體和配體結(jié)合后發(fā)生兩次分裂。第一次分裂由ADAM家族的蛋白酶腫瘤壞死因子酶α轉(zhuǎn)化酶(TACE)介導(dǎo)，γ-分泌酶催化第二次分裂，釋放出Notch受體胞內(nèi)區(qū)(NICD)，NICD進(jìn)入細(xì)胞核，然后結(jié)合到CSL，人體為CBFl，大鼠為RBPJ，果蠅為無(wú)毛抑制物，線蟲(chóng)為L(zhǎng)ag1。CSL通過(guò)置換輔助抑制物使其由抑制劑轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顒⒄心脊布せ钗铮绮倏v子樣蛋白(MAML)，從而發(fā)揮一系列生物學(xué)作用。

Notch信號(hào)傳導(dǎo)除了通過(guò)與CSL結(jié)合發(fā)揮作用外，還可以通過(guò)CSL非依賴調(diào)控途徑發(fā)揮作用。如Notch/Delta傳遞的信號(hào)可以抑制Ras和JNK依賴性的堿式螺旋-回折-螺旋（bHLH）轉(zhuǎn)錄因子E47的活性^［3］。同時(shí)Notch信號(hào)還受到另外一些分子的修飾，如Fringe、Mastermind、Numb等^［4］。

3 Notch信號(hào)通路與MM發(fā)病相關(guān)機(jī)制

眾所周知，骨髓微環(huán)境在多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病和耐藥中起重要作用，骨髓微環(huán)境則通過(guò)細(xì)胞之間的相互接觸和分泌多種細(xì)胞因子對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的增殖及凋亡產(chǎn)生影響。多種調(diào)節(jié)因子通過(guò)不同的機(jī)制調(diào)節(jié)Notch信號(hào)^［5］，激活Notch信號(hào)也可引發(fā)多種信號(hào)，其中NF-κB2家族是Notch信號(hào)通路的一個(gè)靶基因，后者可以通過(guò)蛋白-蛋白之間作用和基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)NF-κB2的表達(dá)^［6］。如在造血祖細(xì)胞中，NF-κB的激活被Notchl通過(guò)控制NF-κB的轉(zhuǎn)錄而控制。

有研究表明，Notch配體Jagged-1和Delta2在骨髓基質(zhì)細(xì)胞和骨髓內(nèi)巨噬細(xì)胞表面大量表達(dá)。Jundt等^［7］發(fā)現(xiàn)由配體Jagged-1誘導(dǎo)的Notch信號(hào)是通過(guò)調(diào)節(jié)Notch信號(hào)途徑下游靶基因Hes-1而發(fā)揮生物學(xué)作用，最終導(dǎo)致MM細(xì)胞生長(zhǎng)。由于Notch的受體和配體Jagged-1不僅在MM細(xì)胞中大量表達(dá)，而且它的配體也表達(dá)于骨髓基質(zhì)細(xì)胞表面。由此可以推斷，在體外研究中，Notch信號(hào)通路的活化也可能通過(guò)同型和異型細(xì)胞相互作用而發(fā)生。并且有數(shù)據(jù)資料發(fā)現(xiàn)，配體Jagged-1誘導(dǎo)的Notch信號(hào)通路的激活是MM發(fā)生的機(jī)制之一。另外，Notch信號(hào)通路的活化可以促進(jìn)B細(xì)胞性霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，所以，筆者可以大膽猜測(cè)Notch信號(hào)通路的活化也可能是促使血液系統(tǒng)腫瘤發(fā)生的機(jī)制之一，當(dāng)然還有待后續(xù)的研究予以證實(shí)。

已有研究發(fā)現(xiàn)，Notchl蛋白是許多腫瘤中最常檢測(cè)到的Notch家族成員，Notchl蛋白的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。體外研究表明，在ALL、MM等造血系統(tǒng)惡性疾病和多種實(shí)體瘤中均發(fā)現(xiàn)Notchl通路的異常激活，Notch1通路的激活可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲；阻斷Notchl通路可引起細(xì)胞周期阻滯，凋亡增加，對(duì)化療藥物的敏感性增強(qiáng)^［8，9］。MM細(xì)胞中Notch1的激活導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，活化的Notch信號(hào)（ICN）可以阻斷MM細(xì)胞的凋亡^［10］。相關(guān)研究結(jié)果表明，抗凋亡作用是由于Notchl與骨髓基質(zhì)細(xì)胞的相互作用導(dǎo)致p2lWAF/Cip表達(dá)上調(diào)，使得MM細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯在細(xì)胞周期的G0/G1所致。而抑制Notch信號(hào)通路阻止了骨髓基質(zhì)介導(dǎo)的耐藥作用，從而使骨髓瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感。

賈向旭等通過(guò)將逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的胞內(nèi)區(qū)(Notch intracellular domain，ICN)導(dǎo)入骨髓瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)活化的Notch信號(hào)可以阻斷MM細(xì)胞凋亡；Houde等^［11］發(fā)現(xiàn)MM細(xì)胞高表達(dá)Notch的配 體JAG2，而后者誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞分泌IL-6、VEGF、IGF-1，提出可以通過(guò)抗Notch1單克隆抗體干預(yù)Notch1和JAG2結(jié)合阻斷Notch信號(hào)的治療策略，有待進(jìn)一步證實(shí)。Yin^［12］發(fā)現(xiàn)軟骨素合酶(CHSY1)的結(jié)構(gòu)域里含有DDD模序，后者可以調(diào)節(jié)Notch信號(hào)，骨髓瘤中Notch2受體可以通過(guò)CHSY1的siRNA處理而下調(diào)，提示CHSY1通過(guò)DDD模序調(diào)節(jié)Notch信號(hào)可能是MM和骨髓微環(huán)境(破骨細(xì)胞)相互作用的新機(jī)制。Yulia等研究表明，用γ-分泌酶的特異性抑制劑GSI可通過(guò)抑制ICN的釋放從而特異性抑制Notch信號(hào)通路，進(jìn)而誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞的凋亡，但卻不會(huì)影響正常的造血祖細(xì)胞生長(zhǎng)。

γ-分泌酶抑制劑（GSI）作為特異性抑制Notch信號(hào)通路的阻斷劑，它的細(xì)胞毒作用主要是通過(guò)下調(diào) Hes-1基因和上調(diào)促凋亡蛋白Noxa達(dá)到的。更重要的是，當(dāng)用RNA干擾技術(shù)下調(diào)促凋亡蛋白Noxa的表達(dá)時(shí)，可以阻斷由GSI所誘導(dǎo)的MM細(xì)胞凋亡。相關(guān)數(shù)據(jù)提示，Noxa在GSI所誘導(dǎo)的MM細(xì)胞凋亡機(jī)制中發(fā)揮著主要作用。眾所周知，Noxa的促凋亡作用是與抗凋亡蛋白Mcl-1相關(guān)聯(lián)的，而在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系RPMI8226細(xì)胞中Noxa的促凋亡作用則是與Bad蛋白相關(guān)的；Hes-1蛋白（即轉(zhuǎn)錄抑制子）有可能直接抑制Noxa蛋白的表達(dá)，但目前還沒(méi)有相關(guān)資料證明這種作用機(jī)制。同時(shí)GSI可以使骨髓基質(zhì)調(diào)節(jié)的MM細(xì)胞免于凋亡的機(jī)制發(fā)生逆轉(zhuǎn)，正是由于GSI這種作用明顯增強(qiáng)了傳統(tǒng)化療藥（如阿霉素和馬法蘭）的化療作用^［9］。

4 阻斷Notch信號(hào)通路治療MM研究

隨著對(duì)MM病因及其發(fā)生機(jī)制的深入研究，針對(duì)骨髓微環(huán)境與瘤細(xì)胞的相互作用、瘤細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的藥物治療備受重視。目前已不再局限于細(xì)胞毒藥物降低腫瘤負(fù)荷，而是開(kāi)發(fā)可選擇性殺傷瘤細(xì)胞而無(wú)損于正常細(xì)胞的新藥。

4.1 三氧化二砷(ATO，As2O3) ATO可從多方面對(duì)MM起作用，如抑制增殖，誘導(dǎo)凋亡；特異性和非特異性免疫增強(qiáng)作用；抗血管生成；阻斷TNF誘導(dǎo)的MM細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞的黏附等。臨床主要用于治療晚期或耐藥MM患者，單用As2O3或聯(lián)合其他藥物治療MM均有一定療效^［13~15］。鄭云波等^［16］的印跡分析研究表明，As2O3能降低Notchl和Hesl水平，提示As2O3對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系TSC的抑制作用是通過(guò)抑制Notch信號(hào)的活性而發(fā)揮抗腫瘤作用。目前關(guān)于As2O3對(duì)骨髓瘤治療作用的研究主要還集中于基礎(chǔ)研究。

4.2 Numb蛋白 Numb蛋白是一種Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白，類似于一種接頭蛋白，含有兩個(gè)與內(nèi)吞作用有關(guān)的三肽序列，其N端含有磷酸化酪氨酸結(jié)合區(qū)(PTB)，C端含有脯氨酸富集區(qū)。通過(guò)人工模擬合成類似Numb蛋白的小分子肽類藥物，來(lái)拮抗Notch受體，可作為Notch信號(hào)抑制劑的一個(gè)研究方向^［17］。

4.3 小分子抑制物 近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，一些小分子化合物可以通過(guò)抑制Notch通路達(dá)到抗腫瘤的目的。Wang等^［18］研究表明，染料木黃酮通過(guò)抑制Notch1和核因子NF-κB的活性及它們之間的相互作用，抑制胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)凋亡。筆者可以猜測(cè)，這些小分子化合物是否可以抑制骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)還有待進(jìn)一步研究證明。

4.4 γ-分泌酶抑制劑 以γ-分泌酶為藥物作用靶點(diǎn)的γ-分泌酶抑制劑，對(duì)Notch信號(hào)通路有抑制作用，有可能成為非常有效的腫瘤治療藥物。Jundt^［7］等在研究多發(fā)性骨髓瘤時(shí)還發(fā)現(xiàn)，初期多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞以及骨髓間質(zhì)細(xì)胞中均高表達(dá)Jagged1，髓內(nèi)外研究提示，Notch1和Notch2在初期多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中也高表達(dá)，當(dāng)Jagged1激活Notch通路時(shí)，下游基因Hes1表達(dá)明顯增加。γ-分泌酶抑制劑DAPT能抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并且使得Hes1表達(dá)下調(diào)。

5 展望

由于Notch通路的異常活化在腫瘤發(fā)生中起著重要的作用，以Notch通路作為抗腫瘤治療靶點(diǎn)的腫瘤治療藥物是一個(gè)新的研究領(lǐng)域。目前多種新型藥正處于臨床試驗(yàn)階段。ATO等則對(duì)于復(fù)發(fā)和(或)難治MM患者有穩(wěn)定作用。而Numb蛋白、小分子抑制物、γ-分泌酶抑制劑等新型藥物也將給多發(fā)性骨髓瘤患者帶來(lái)新的希望。今后如何將患者分為亞群來(lái)使用不同的治療以及怎樣聯(lián)合使用這些以生物學(xué)為基礎(chǔ)的治療將是面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2011-10-13）

（本文編輯：郎威）