甲基化抑制劑對腎癌細胞株中γ-caenin蛋白表達的影響

【摘要】 目的 研究甲基化抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷（5-Aza-CdR）對人腎癌A498細胞增殖及γ-連環蛋白（γ-catenin）表達的影響。方法 使用不同濃度（10-7、10-6、10-5 mol/L）的特異性DNA甲基轉移酶抑制劑5-Aza-CdR處理A498腎癌細胞株。MTT檢測5-Aza-CdR對腎癌細胞株A498抑制作用。細胞免疫化學檢測5-Aza-CdR處理A498腎癌細胞株后γ-catenin表達的變化。結果 5-Aza-CdR能明顯抑制腎癌細胞的增殖，且與藥物濃度及作用時間有關。藥物處理后γ-連環蛋白表達增加。結論 γ-catenin蛋白表達受甲基化的抑制，提示5-Aza-CdR可使γ-catenin基因去甲基化而抑制A498腎癌細胞株增殖。

【關鍵詞】 5-氮雜-2-脫氧胞苷； 腎癌A498細胞株； γ-連環蛋白； 免疫組化

Expression of γ-catenin protein and its methylation regulation in human renal carcinoma line A498 TAO Mei-man，GUO Tao，SUN Hao.The affiliated hospital of jiangsu university，Zhenjiang 212001，China

【Abstract】 Objective To investigate the effect of methylation inhibitor 5-Aza-2-deoxycytidine on the growth of human renal cancer cell line A498 andγ-catenin expression.Methods Human renal carcinoma A498 cells were treated with different concentrations of 5-Aza-CdR（10-7，10-6，10-5 mol/L） respecttively.Then the growth rate of the cells was detected by MTT assay.The immuneocytochemistry was used to detectγ-catenin levels in the cell line before and after treatment with 5-Aza-CdR.Results 5-Aza-CdR can inhibit the growth of A498 cells，γ-catenin expression levels in A498 cells were increased after 5-Aza-CdR treatment.Conclusion γ-catenin expression levels were inhibited by methylation， 5-Aza-CdR can inhibit the growth of A498 cells by inducing demethylation in the promoter region ofγ-catenin gene.

【Key words】 5-Aza-2-deoxycytidine； A498 cell lines； γ-catenin； Immunocytochemistry

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腎細胞癌是人泌尿系統最常發生的惡性腫瘤，其發病率在我國泌尿生殖系統惡性腫瘤排在第二位，僅次于膀胱癌，占全身惡性腫瘤的3%^［1］。腎細胞癌的發生、發展與多種因素有關，抑癌基因失活是關鍵因素之一。研究表明，抑癌基因失活的主要方式有基因的缺失、突變和啟動子區域的過甲基化等^［2］。γ-catenin是一種多功能蛋白質。近年研究顯示，γ-catenin蛋白在多種腫瘤中表達減少。國外有研究證實，在腎癌組織及細胞其表達明顯下調^［3］，啟動子區域CpG島的過甲基化可能是其失活的主要方式，國內尚無相關的報道。筆者采用5-氮-2-脫氧胞苷對腎癌細胞株進行處理，檢測γ-catenin蛋白表達，進一步研究腎癌細胞中γ-catenin蛋白表達下降是否與基因甲基化有關，探索增加或恢復腎癌細胞中γ-catenin蛋白正常表達的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎癌細胞株A498購于上海細胞生物所，胎牛血清（杭州四季青）；DMEM培養基、胰酶、DAB顯色試劑盒及SABC試劑盒（sigma公司）；5-Aza-CdR（sigma公司），用PBS充分溶解后保存于-70 ℃冰箱備用；兔抗人γ-連環蛋白多克隆抗體、MTT及二甲亞楓（sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組方法 將濃度分別為10-7、10-6、10-5 mol/L 5-Aza-CdR處理過的人腎癌細胞株A498分為三組，未經5-Aza-CdR處理過的A498作為對照組。

1.2.2 細胞培養 人腎癌細胞株A498用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養（37 ℃，5% CO2 飽和濕度），隔日換液，細胞長滿培養瓶壁的80%～90%后，按照1：3傳代，取對數生長期的細胞進行試驗。

1.2.3 MTT法測細胞增殖活性 對數生長期細胞以每孔5000個細胞密度接種于五塊96孔板中，過夜貼壁后，加入不同濃度的5-Aza-CdR，每孔180 μl，每組設5個復孔，并設不加藥的對照孔和不接種細胞的調零孔。藥物和培養液每24 h更換1次，每天取出1板，加入5 g/L的MTT溶液20 μl，37 ℃、5%CO2培養箱中繼續培養4 h后棄去上清，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min充分溶解結晶，置酶聯免疫檢測儀上測定波長490 nm下的光密度值，細胞生存率以平均光密度（D）值分析，以D值為縱坐標，以時間（d）為橫坐標，繪制生長曲線圖。

1.2.4 細胞免疫化學法檢測γ-catenin表達 采用細胞爬片法，按試劑盒說明采用ABC三步法。參照Bames等^［4］方法進行半定量評分（分A、B兩項）：A項，按切片中細胞顯色深淺計分，0分為細胞無顯色，1分為顯淺黃色，2分為顯黃色，3分為顯棕黃色；B項，按顯色細胞的比例評分，1分為1%～30%，2分為31%～75%，3分為76%～100%。兩項指標結合積分：陰性（-）積分為0分；陽性（+）積分為1～4分；強陽性（++）積分為5～6分。每組計數5個視野，每個視野計數200個細胞。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件包進行統計學分析，正態數據組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，非正態數據組間兩兩比較采用Nemenyi法檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度5-Aza-CdR抑制A498細胞增殖的結果 MTT檢測發現5-Aza-CdR能抑制人腎癌細胞株A498增殖(圖1)，且與時間和藥物濃度有關。

2.2 細胞免疫組化結果 10-7、10-6、10-5 mol/L組間采用Kruskal-Wallis H 檢驗，差異有統計學意義（H=228.92，P<0.01）。進一步采用Nemenyi法兩兩比較，10-7 mol/L和10-6 mol/L組5-Aza-CdR比較，差異有統計學意義（χ2 =252.16，P<0.01）；10-7 mol/L和10-5 mol/L組5-Aza-CdR比較，差異有統計學意義（χ2 =396.48，P<0.01）；10-6 mol/L和10-5 mol/L組5-Aza-CdR比較，差異有統計學意義（χ2=12.87，P<0.01）。表明經甲基化抑制劑處理后γ-catenin表達增加，見表1。

3 討論

γ-catenin是一種多功能蛋白質，分子量約為83 kD，基因定位于17q21上，參與由E-cadherin介導的細胞間黏附與信號傳導兩大功能。研究顯示，γ-catenin在非小細胞癌、乳腺癌^［5，6］等多種腫瘤中表達減少，與腫瘤的發生、發展密切相關，但其在腫瘤中表達下降的機制尚不清楚。研究表明，抑癌基因的失活和表達降低與其啟動子區域的高甲基化狀態有關^［7，8］，而DNA甲基轉移酶的表達水平升高和活性增加被認為是引起抑癌基因啟動子區域發生發生高甲基化的主要原因之一^［9］。5-Aza-CdR是DNA甲基轉移酶1(DNMT1)的抑制劑，體外實驗證明其可抑制多種腫瘤細胞的生長。腎癌中γ-catenin表達減少可能與其基因甲基化有關^［3］，國內尚無相關研究。

本實驗用5-Aza-CdR處理人腎癌細胞A498后，從MTT法檢測的細胞生長曲線可以看出細胞增殖受到不同程度的抑制。免疫組化顯示，A498細胞經5-Aza-CdR處理后γ-catenin蛋白表達增加，且與5-Aza-CdR濃度有關，細胞生長緩慢，惡性程度下降，說明γ-catenin蛋白具有抑制腎癌細胞生長的作用。同時γ-catenin蛋白表達受甲基化的抑制，5-Aza-CdR可使γ-catenin基因去甲基化恢復γ-catenin蛋白表達，這說明腎細胞癌中γ-catenin基因可能存在過度甲基化，而其過甲基化就是引起γ-catenin蛋白在腎癌細胞株中表達下降甚至缺失的主要機制，這需要更深入的研究。目前，5-Aza-CdR在國外已有用于治療白血病的嘗試^［10］。

γ-catenin蛋白在腎癌細胞株中表達明顯下降，5-Aza-CdR能恢復其表達。進一步對γ-catenin基因甲基化的研究為腎細胞癌治療的一個新靶點。

參 考 文 獻

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［4］ Bames DM，Dublin EA，Fisher CJ，et al.Immunohistochemical detection of P53 protein in mammary carcinoma:an important new independent indicator prognosis［J］.Hum Pathol，1993，24(5):469-476.

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［6］ Sarrio D，Moreno G，Hardisson D，et al.Epigenetic and genetic alterationns of APC and CDH1 genes in lobular breast cancer:relationships with abnormal E-cadherin and catenin expression and microsatellite instability［J］.Int J Cancer，2003，106(2):208-215.

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（收稿日期：2011-11-08）

（本文編輯：車艷）