中介素1-53對急性肺損傷大鼠SP-A及IL-18的影響

[摘要] 目的 探討脂多糖致急性肺損傷大鼠肺泡灌洗液（BALF）中表面蛋A（pulmonary surfactant associated protein A，SP-A）濃度及肺組織單核巨噬細胞中白介素18（interleukin 18，IL-18）的表達水平及中介素1-53（intermedin1-53，IMD1-53）的影響。 方法 將36只雄性Vistar大鼠隨機分為正常組（A組）、急性肺損傷組（B組）、中介素1-53干預組（C組），于2 h，4 h分別測定血氣分析，后處死大鼠，測定肺組織濕/干比（W/D）、ELISA法檢測BALF中SP-A的濃度、免疫組化法檢測肺單核巨噬細胞內IL-18表達及各時間點肺組織病理變化。 結果 與A組比較，B組動脈血PO2和BALF中SP-A濃度降低顯著（P < 0.05），濕干比及單核巨噬細胞中IL-18表達增加（P < 0.05），肺組織充血水腫明顯。與C組相比，上述改變得以逆轉，肺損傷程度明顯減輕（P < 0.05）。 結論 中介素1-53可通過抑制SP-A的減少和IL-18的生成在急性肺損傷早期起到一定的保護作用。

[關鍵詞] 急性肺損傷；中介素1-53；SP-A；IL-18

[中圖分類號] R563 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2012）03-0001-03

Effects of intermedin 1-53 on SP-A and IL-18 in LPS-induced acute lung injury septic rats

LIU Ling1 LI Jianqiang2 SHI Jing1 ZHAO Hui2

1.Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China; 2.Department of Respiration， the Second Hospital of Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China

[Abstract] Objective To explore the influence of intermedin1-53 on the leve of SP-A in BALF and IL-18 expressions of alveolar macrophages in lipopolysaccharide of LPS-induced acute lung injury (ALI) in rats. Methods All of 36 male Wistar rats were randomly divided into 3 groups: normal control (A)， LPS-treated group (B)， intermediary 1-53 intervention group (C). Blood samp leswere taken for blood gas analysis at 2， 4 h.The animals were killed after 4 h， the ratio of wet to dry lung weight was measured. The concentration of SP-A in BALF with ELISA method. The exression of IL-18 was examined by immunohistochemical method and the changes of lung tissue were pathol ogically observed. Results Compared with group A， PO2 and SP-A had a decreased significantly in 2 and 4 hours in group B (P < 0.05）. The ratio of wet to dry lung weight and the expressi of IL-18 alveolar macrophages in lipopolysaccharide had a increased significantly in group B (P < 0.05)， The degree of lung injury was hardly. These changes were inverted in group C， and the degree of lung injury was markedly at tenuated (P < 0.05). Conclusion The intermediary 1-53 through inhibide the decreased of SP-A and expression of in the early stage of acute lung injury has a protactive function.

[Key words] Acute lung injury (ALI); Intermedin1-53 (IMD1-53); Pulmonary surfactant protein A (SP-A); Interleukin-18(IL-18)

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是各種直接或間接致傷因素導致的急性低氧性呼吸功能不全，臨床上主要表現為難以糾正的低氧血癥及進行性加重的呼吸困難。ALI是急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的早期階段。二者本質來源于過度炎癥反應所致肺內皮細胞和肺上皮細胞的廣泛損傷[1-2]，各種炎性因子的釋放及肺表面活性物質的缺乏使ALI的生理過程成為一個惡性循環，只有在疾病早期有效地控制 ALI的發展進程，才能遏制 ARDS的產生和發展。中介素（IMD）是2004年Roh[3]等用種系特征方法分析基因庫，從人類和其他脊椎動物基因組證實的一種新的降鈣素（CT）/降鈣素基因相關肽（CGRP）家族。IMD前體蛋白可被內源性肽酶降解為prepro-IMD95-147即IMD1-53，目前國內外有報道IMD1-53對油酸致急性肺損傷、心肌缺血再灌注損傷、腎臟缺血再灌注損傷及肺缺血再灌注損傷均有保護作用，但其保護作用主要集中在抗氧化方面[4-7]，與SP-A及IL-18相關聯的研究目前尚無報道。本實驗通過檢測不同處理條件下BALF中SP-A及肺單核巨噬細胞胞漿中IL-18的表達水平，了解IMD1-53在急性肺損傷早期所發揮的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物分組和處理

8周齡健康雄性Wistar大鼠（山西醫科大學實驗動物中心提供）36只，體重（200±20）g，隨機分為正常組、急性肺損傷組、中介素1-53干預組，每組各12只。采用大鼠尾靜脈注射脂多糖（LPS）5 mg/kg，制作大鼠急性肺損傷模型，正常組注入1 mL的生理鹽水，而中介素1-53干預組在尾靜脈注入脂多糖前1 h將2 nmol/kg中介素1-53溶于1 mL生理鹽水注入腹腔，其他兩組均注入1 mL的生理鹽水。分別于2 h及4 h兩個點采集標本。

1.2試劑

IMD1-53粉劑：美國phoenix公司；脂多糖：美國sigma公司；兔抗大鼠IL-18多克隆抗體：北京博奧森生物公司；SP-AELISA試劑盒：上海地澤生物公司。

1.3 檢測指標和方法

1.3.1 PaO2測定 留取腹主動脈血通過全自動血氣分析儀進行檢測。

1.3.2 肺 W/ D比值測定 正常組、急性肺損傷組和IMD1-53干預組動物做肺組織 W/ D比值測定。動物麻醉放血處死后開胸，游離雙肺，結扎并剪下右肺，稱取右肺中下肺葉濕重，后置55℃烤箱干燥，48 h后取出，稱取干重，計算肺 W/D比值。

1.3.3 BALF中SP-A濃度測定 動物麻醉放血處死后開胸，游離雙肺及主支氣管，在氣管分叉處結扎右肺，用4℃生理鹽水5 mL灌洗左肺，反復抽吸7～8次，后取灌洗液3 mL移至離心管中，4℃下經 3000 r/min離心 10 min，留取取上清液備用，采用 ELISA方法測定 BALF中SP-A濃度。

1.3.4 病理檢查 取右肺上葉組織塊，用10％甲醛同定，予以常規石蠟包埋、切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察肺組織病理學變化。

1.3.5 免疫組化方法測肺單核巨噬細胞中IL-18的表達 將上述組織蠟塊連續切片采用體積分數為3%過氧化氫封閉，微波爐抗原熱修復，滴加一抗（兔抗大鼠IL-18多克隆抗體）及相應二抗工作液，滴加辣根過氧化物酶工作液，DAB顯色，脫水，透明，封片。陽性表達為細胞漿內棕黃色顆粒。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統處理，分別測每視野的陽性表達的吸光度。

1.4 數據處理

所有實驗數據用均數±標準差表示，用SPSS 19.0軟件進行多組資料方差分析，各時點組間多重比較采用LSD-t檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PaO2變化

在脂多糖誘發ALI后（B組）2 h，4 h點PaO2顯著低于正常對照組（P ＜ 0.01），予IMD1-53干預后各時相 PaO2均顯著升高（P ＜ 0.01）。見表1。

2.2 大鼠肺 W/D變化

B組各時間點肺 W/D比值顯著高于A組（P < 0.01）。IMD1-53干預后則比值減小（P < 0.05或P < 0.01），C組各時間點均值均較A組高，2 h點相比差異有統計學意義（P < 0.01），而4 h點差異無統計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.3 組織病理學變化

B組大體標本可見肺組織腫脹，散在出血點；光鏡下觀察見肺泡間隔明顯增寬，肺泡壁完整性破壞，肺組織大量炎癥細胞浸潤，肺泡腔紅細胞及單核巨噬細胞滲出，局部透明膜形成，伴局灶性肺不張和肺氣腫。隨病程的延長，病變程度逐步加重，C組各時相組病變程度均較B組各相應時相組減輕。見圖1～2。

2.4 BALF中SP-A濃度的變化

與A組各時間點相比，B組BALF中SP-A濃度下降明顯（P < 0.01），C組與B組各時間點相比，SP-A濃度明顯增高（P < 0.05或P < 0.01）。見表1。

2.5 肺泡巨噬細胞胞漿IL–18的表達變化

免疫組化結果示：B組各時間點測得肺單核巨噬細胞中IL-18吸光度A組明顯升高（P < 0.05或P < 0.01），IMD1-53干預后，C組IL-18吸光度下降顯著（P < 0.05或P < 0.01）。見表1。

3 討論

本研究采用尾靜脈注射脂多糖誘發ALI的模型，動物致傷后，病理顯示，肺組織結構受損，大量炎癥細胞浸潤，肺 W/D比值增加，PaO2進行性下降，BALF中SP-A濃度逐漸減少，肺單核巨噬細胞合成IL-18明顯增加，均提示 ALI的存在，且隨致病時間的延長，損傷呈逐步加重的趨勢。運用外源性IMD1-53對其進行干預處理后，大鼠急性肺損傷程度明顯減輕，與急性肺損傷組比較差異有統計學意義，提示IMD1-53在急性肺損傷早期可發揮保護作用。

SP-A是由肺泡Ⅱ型上皮細胞（AT-Ⅱ）合成、分泌的，對于維持肺泡的正常結構與功能起著重要作用。肖燕等[8]證實BALF中SP-A 的含量在ALI后1 h 就出現明顯降低，并在6h內維持較低水平。有實驗證實在BALF 中 ALI患者比正常低50%～70%[9]，其原因可能是由于肺損傷引起 Ⅱ型上皮細胞腫脹、脫落，大量炎癥細胞侵入，釋放大量氧自由基、細胞因子及蛋白水解酶，破壞增加，生成減少，從而造成 SP-A 含量降低[10-11]。同時由于肺泡毛細血管膜通透性增高，造成血管內大分子和 PS的雙向滲漏，導致 SP-A降解增加[12]。生成減少和丟失嚴重是造成急性肺損傷BALF中SP-A濃度顯著減少的主要原因。Lin和Ware等[13-14]認為SP-A可作為反映ALI/ARDS后Ⅱ型細胞功能的早期指標，也是判斷患者肺損傷程度和預后的指標。本實驗BALF中SP-A濃度變化與上述實驗結果相符，同時IMD1-53干預后SP-A濃度升高明顯，說明IMD1-53在急性肺損傷早期可通過抑制SP-A的減少發揮保護作用，但具體機制到目前仍不十分明確，可作為我們今后研究的新方向。

IL-18 是新近發現的一種炎性細胞因子，屬于IL-1β超家族，IL-1的特征樣結構主要由活化的肺臟單核巨噬細胞產生。IL-18可以誘導炎癥早期細胞因子的產生，如TNF-α、IL-1β等，這些細胞因子進一步促進下游的細胞因子產生，如IL-8、巨噬細胞炎性蛋白 -1α（MIP-1α）和單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）等[15]。IL-18和多種炎性因子造成的炎癥瀑布效應導致ALI的發生和發展[16]。近期研究亦表明，ARDS 患者的死亡率與患者IL-18水平呈正相關[17]。本實驗結果顯示，急性肺損傷后肺單核巨噬細胞中IL-18合成增加，說明IL-18在ALI的早期參與損傷機制。而應用IMD1-53進行干預后，其合成水平較損傷時間點明顯下降，且組織病理損傷程度減輕，說明IMD1-53在ALI早期即可發揮較強的抗炎作用，是遏制ALI發生和發展的一個治療手段。

IMD1-53是一種新型生物制劑，其對很多器官的缺血再灌損傷及急性肺損傷都有保護作用，本實驗驗證了IMD1-53對急性肺損傷的保護作用，但IMD1-53目前還未應用于臨床，但其給我們臨床治療及藥物的開發指明了新的方向。

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（收稿日期：2011-12-02）