L－纈氨酸的發酵工藝條件研究

曾青蘭，孫連連，王志勇

（咸寧職業技術學院 生物工程系，湖北 咸寧 437100）

L－纈氨酸是人體必需氨基酸之一，具有多種生理功能.在醫藥上，L－纈氨酸主要用于配制復合氨基酸制劑，特別是應用于配制高支鏈氨基酸輸液及口服液.國內外大批量生產L－纈氨酸均采用微生物發酵法［1］.作者采用谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）CICC20887，在搖瓶條件下研究發酵工藝條件對L－纈氨酸產量的影響，以期為該菌工業化發酵生產L－纈氨酸奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 菌種

谷氨酸棒桿菌CICC20887，購自中國工業微生物菌種保藏管理中心.

1.2 培養基配方

1.2.1 斜面培養基配方 葡萄糖：5.0g／L，NaCl：5.0g／L，牛肉膏：10.0g／L，蛋白胨：10.0g／L，酵母膏：5.0g／L，瓊脂條：20.0g／L.用30% 的NaOH調pH＝7，0.1MPa滅菌20min［2］.

1.2.2 種子培養基配方 葡萄糖：25.0g／L，硫酸銨：5.0g／L，玉 米 漿：40.0g／L，豆餅水解液：2.5g／L，磷酸二氫鉀：1.0g／L，硫酸鎂：0.5g／L，硫酸亞鐵：0.01g／L，硫酸錳：0.01g／L，輕質碳酸鈣：10.0g／L，L－Met：0.3g／L，L－Ileu：0.2g／L，生物素（VH）：100 μg／L，硫胺素（VB1HCl）：200μg／L.用30%的 NaOH 的調pH＝7，滅菌條件0.1MPa滅菌20min［3］.

1.2.3 發酵培養基配方葡萄糖：70.0～120.0g／L，硫酸銨：40.0g／L，玉米漿：25.0g／L，磷酸二氫鉀：1.0g／L，硫酸鎂：0.5g／L，硫酸亞鐵：0.01g／L，硫酸錳：0.01g／L，輕質碳酸鈣：10.0g／L，生物素（VH）：20～100μg／L，硫胺素（VB1HCl）：200μg／L.用30%的 NaOH 調pH＝7，0.07MPa滅菌20min［2］.

1.3 發酵工藝條件的設定

采用單因素實驗，設定不同發酵工藝條件進行搖瓶發酵，分析不同的發酵工藝條件對谷氨酸棒桿菌CICC20887產纈氨酸的影響.

1.4 L－纈氨酸測定方法

采用紙上層析法.

1.4.1 標準曲線的制定 精密稱取纈氨酸標準品0.06g、0.14g、0.22g、0.30g、0.38g、0.46g，分別置于10ml容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻.分別吸取1μL于層析濾紙上，在層析液［V（正丁醇）∶V（冰乙酸）∶V（H2O）＝4∶1∶1］中展開，60℃烘干，用0.05%茚三酮－丙酮溶液噴濕，60℃烘干，顯色［3］.剪下斑點放入10mL的 CuSO4－75%C2H5OH溶液洗脫，常溫靜置2h，直至斑點完全洗脫［4，6］.以洗脫劑作空白對照，在S22PC型分光光度計520nm處測定洗脫液的吸光度，以纈氨酸標含量作橫坐標，以洗脫液的吸光度作縱坐標，用Excel軟件處理，得纈氨酸標準曲線和回歸方程.

1.4.2 發酵液中L－纈氨酸含量的測定 取發酵液高速離心（8 000r／min）2min，上清液置于4℃冷藏待測.根據發酵液中L－纈氨酸濃度確定樣品稀釋倍數.

取纈氨酸稀釋發酵液1μL點樣于層析濾紙上，照上法操作，測得吸光度，從標準曲線上換算出纈氨酸含量.

1.5 pH值測定方法

精密pH 試紙，pH：6.0～8.0或pH 計.

2 結果與討論

2.1 初糖濃度對L－纈氨酸產量的影響

谷氨酸棒桿菌CICC20887在30℃，搖床轉速為120r／min時，搖瓶發酵72h時，不同初糖濃度對L－纈氨酸產量的影響如圖1.結果表明，發酵培養基中初糖濃度為90g／L時，發酵72h，L－纈氨酸的相對含量最高，過高或過低L－纈氨酸的相對含量明顯下降.因為在發酵過程中，葡萄糖既為菌體生長提供所需的碳源，也為菌體合成L－纈氨酸提供所需碳的骨架，葡萄糖過低，限制了菌體的生長和L－纈氨酸的合成，但若過高，則會增加菌體外環境的滲透壓，使發酵速度變慢，產酸率也會下降.

圖1 初糖濃度對L－纈氨酸產量的影響Fig.1 Effect of concentration of initial glucose on the yield of L－valine

2.2 生物素對L－纈氨酸產量的影響

圖2 生物素對L－纈氨酸產量的影響Fig.2 Effect of D－biotin on the yield of L－valine

谷氨酸棒桿菌為生物素（VH）需求型.生物素作為酶的輔助因子以多種方式參與細菌的代謝過程，因此，生物素的用量直接影響生產菌的細胞生長、增殖、代謝及細胞壁、細胞膜的通透性和產酸量的高低.在L－纈氨酸的生產中，生物素不足，代謝途徑會向三羧酸循環方向發展，不利于L－纈氨酸的生成，因此，生物素要求相對過剩些.圖2反映了生物素的不同添加量對L－纈氨酸產量的影響.結果表明，發酵培養基中生物素添加量為80μg／L時，搖瓶發酵72h，L－纈氨酸的相對含量最高.

2.3 VB1的不同添加量對L－纈氨酸產量的影響

圖3反映了不同的VB1添加量對L－纈氨酸產量的影響.發酵培養基中VB1添加量為0.20mg／L時，搖瓶發酵72h，L－纈氨酸的相對含量最高，隨著VB1添加量的增大，L－纈氨酸的相對含量明顯下降，這可能是由于過量的VB1在菌體內轉化成硫銨素焦磷酸（TPP），后者作為丙酮酸脫氫酶復合體系的輔助因子，促進了丙酮酸脫氫生成乙酰CoA進入TCA循環，從而減少了L－纈氨酸的合成.

2.4 玉米漿對L－纈氨酸產量的影響

玉米漿成分較為復雜，含氨基酸、生物素等多種營養因子，為谷氨酸棒桿菌生長與代謝提供了必要的營養成分，對菌體的生長有明顯的促進作用.圖4反映了不同的玉米漿添加量對L－纈氨酸產量的影響.結果表明，發酵培養基中玉米漿添加量為30g／L時，搖瓶發酵72h，L－纈氨酸的相對含量最高.

圖3 VB1對L－纈氨酸產量的影響Fig.3 Effect of VB1on the yield of L－valine

圖4 玉米漿對L－纈氨酸產量的影響Fig.4 Effect of corn syrup on the yield of L－valine

2.5 pH對L－纈氨酸產量的影響

本實驗采用了2種pH值的形式：自然pH和前期（前24h）pH 值控制在6.5～6.7、中后期（后48h）控制在7.0～7.2.結果（圖5）表明，后一種形式所獲L－纈氨酸產量比未調pH的高出1倍多.

2.6 培養溫度對L－纈氨酸產量的影響

溫度是影響生物菌種的生長和產酸的一個基本物理因素.實驗結果（圖6）表明，該菌發酵產L－纈氨酸的適宜溫度為30～31℃.

圖5 pH對L－纈氨酸產量的影響Fig.5 Effect of pH on the yield of L－valine

圖6 溫度對L－纈氨酸產量的影響Fig.6 Effect of temperature on the yield of L－valine

2.7 培養時間對L－纈氨酸產量的影響

在上實驗確定的適宜的發酵條件下進行搖瓶發酵，在發酵過程中每隔6h取樣檢測，結果如圖7所示.從圖中可以看出，谷氨酸棒桿菌CICC20887在24h即可檢測到L－纈氨酸的存在，其產L－纈氨酸的高峰在66～72h，此為該菌的最佳發酵周期，此后發酵液中的L－纈氨酸量開始減弱.

3 結論

圖7 培養時間對L－纈氨酸產量的影響Fig.7 Effect of incubating time on the yield of L－valine

谷氨酸棒桿菌CICC20887的發酵工藝條件研究表明，發酵生產L－纈氨酸的適宜初糖濃度為90g／L，添加生物素、玉米漿、VB1有利于L－纈氨酸的生產，其適宜添加量分別為80μg／L、30g／L、0.20mg／L，發酵期間，前24hpH 值應控制在6.5～6.7、后48h應控制在7.0～7.2，發酵適宜溫度為30～31℃，發酵周期應控制在66～72h.次研究結果可為該菌工業化發酵生產L－纈氨酸提供基礎.

［1］趙麗麗，陳 寧，熊明勇，等.低糖流加法生產L－纈氨酸發酵工藝條件的研究［J］.中國生物工程雜志，2003，23（1）：17－21.

［2］楊 毅，章志蘭，姜緒林，等.生物素和 VB1在谷氨酸棒桿菌過量合成纈氨酸中的作用［J］.食品與生物技術學報，2005，24（4）：57－65.

［3］張偉國，錢 和.L－纈氨酸發酵條件的研究［J］.氨基酸和生物資源，2001，23（3）：28－31.

［4］曾祥群，周海濱.纈氨酸提取工藝研究［J］.發酵科技通訊，2001，30（1）：22～24.

［5］傅立明，張愛萍，溫寶珍.氨基酸在紙層析中的分離［J］.山西醫科大學學報，1998，29（4）：384.

［6］余 煒，伍時華，廖 蘭，等.紙色譜法分離發酵液中L－亮氨酸的研究［J］.廣西工學院學報，2003，14（4）：59－61.