Bmi-1在結直腸癌卵巢轉移患者中的表達及意義

李景文 王錫山

結直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一。在我國發病率很高，40%～50%接受結直腸癌切除的患者死于腫瘤復發和轉移[1]。常見的遠處轉移器官為肝臟，其次為肺、骨、腦，而卵巢轉移相對較少見，同時性卵巢轉移癌的發生率為3.6%～7.4%，異時性卵巢轉移癌的發生率約1.5%[2]。雖然卵巢轉移癌的發生率較低，但一旦發生卵巢轉移就意味著晚期，疾病進展較快，預后較差，所以了解腸源性卵巢轉移癌的分子機制至關重要。

B細胞特異單克隆白血病毒整合位點1(B-cell specific moloney leukemia virus insertion site 1,Bmi-1)，Bmi-1是首個被報道與癌癥生長有關的PcG基因。Bmi-1作為原癌基因與c-myc共同作用，促進細胞轉化和腫瘤形成，并直接參與干細胞的自我更新[3]。近年來在胃癌、鼻咽癌、乳腺癌、結直腸癌、卵巢癌以及部分血液系統惡性疾病中均發現Bmi-1的異常表達[4-9]，而關于腸源性卵巢轉移癌的報道甚少。本研究通過免疫組織化學染色，檢測Bmi-1蛋白在正常腸黏膜、結直腸癌、腸源性卵巢轉移癌中的表達，探討Bmi-1與結直腸癌臨床病理因素的關系、臨床意義及其在卵巢轉移過程中的作用。

材料與方法

一、標本和臨床資料

從2010年4月到2011年7月收集哈爾濱醫科大學附屬第三醫院結直腸外科手術切除的腸源性卵巢轉移癌患者44例及配對正常黏膜20例和原發灶25例。年齡(51.0±11.3)歲，其中同時性轉移者15例，異時性轉移者29例，伴淋巴結轉移者29例，不伴淋巴結轉移者15例，44例患者均無其他遠隔臟器轉移。

二、免疫組織化學染色

標本均經10%福馬林固定，常規石蠟包埋。將44例配對的標本行常規4 μm連續組織切片，固定于經1 g/L多聚賴氨酸防脫片處理的載玻片上，60℃連續烤片7 h，常溫保存備用。采用pv-9003法(pv-9003試劑盒購自北京中杉公司)進行免疫組織化學染色，切片使用檸檬酸修復液修復和過氧化氫封閉后滴加一抗，4℃過夜，次日滴加pv-9003試劑盒中試劑A和B，DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片，用PBS代替一抗作陰性對照。

三、結果判定

Bmi-1蛋白陽性表達為細胞核內呈現棕黃色或者棕褐色顆粒。本研究采用IRS綜合評分的方式，高倍鏡下隨機取2個不同視野，計數細胞總數及核陽性細胞數，按照陽性細胞所占百分比，陰性表達為0分；陽性率：1%～10%為1分，11%～30%為2分，31%～50%為3分，51%～80%為4分,>80%為5分。再根據染色強度計分，陰性為0分，弱染色為1分，中度染色為2分，強染色為3分，將每張切片平均著色程度得分與平均著色細胞百分率得分各自相乘，為IRS最終得分：0分為陰性，1～5分為低表達(+)，6～10分為中度表達(++)，>10為高度表達(+++)。

四、統計學分析

所有數據用SPSS 13.0軟件進行統計學處理，Bmi-1與患者生存期關系采用兩獨立樣本t檢驗，Bmi-1與結直腸癌臨床病理因素的關系采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

Bmi-1在直腸癌原發灶中的表達陽性率顯著高于正常黏膜中的表達(分別為65.9%、15.9%，χ2=22.752,P<0.01)；Bmi-1在卵巢轉移癌中表達的陽性率與正常黏膜相比差異無統計學意義(13.6%、15.9%，χ2=0.090,P=0.764)。Bmi-1在直腸癌原發灶中的表達，對于以下影響因素有明顯統計學差異(表1)：結直腸癌的病理類型(χ2=5.116,P<0.05)、術前T分期(χ2=4.856,P<0.05)、術前N分期(χ2=5.495,P<0.05)。而對于以下影響因素無明顯示統計學差異：患者的年齡(χ2=0.030,P>0.05)、是否絕經(χ2=1.349,P>0.05)、原發灶部位(χ2=0.271,P>0.05)、腫瘤大小(χ2=0.024,P>0.05)、卵巢轉移的時間(χ2=0.004,P>0.05)。同時在本研究發現Bmi-1異常表達的患者平均生存期為13.16個月，明顯低于無Bmi-1異常表達者的16.87個月，差異有統計學意義(t=-2.524,P=0.012)。

討論

結直腸癌是消化道常見的惡性腫瘤之一。據國內流行病學調查資料顯示，其發病率排在第3位，僅次于肺癌及乳腺癌，而死亡率已居第4位。它是一個多因素、多步驟逐漸演變的過程，現認為其與主要多基因聯合失調有關[10]。腸癌遠處轉移最常見的器官為肝臟，卵巢轉移的發生率為1.4%～25%，平均約為7%[11]。Bmi-1可能參與大腸癌的發生發展以及淋巴結的轉移[10,12-14].

Bmi-1作為一個原癌基因c-myc共同參與小鼠T、B細胞淋巴瘤的發生。Bmi-1基因定位于10號染色體短臂1區3帶(10p13)，含10個外顯子，其cDNA長為3 203 bp，其開放閱讀框編碼一種326個氨基酸的蛋白，相對分子量為4.4×104～4.6×104[15]。Bmi-1蛋白含有幾個重要的結構域：(1)位于N-末端的環指結構(ring finger domin，R)，該結構域保證Bmi-1蛋白均勻分布在細胞核邊緣易染色質集中的區域是發揮轉錄抑制作用的限制性因素；(2)位于中區域的重復螺旋-轉角-螺旋-轉角-螺旋-轉角結構(HTHTHT結構域)，介導Bmi-1蛋白與DNA的結合；(3)2個核定位信號KRRM和KRMK序列；(4)位于C-末端的富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸的PEST區域，該結構與Bmi-1蛋白在細胞內迅速降解有關[16]。Bmi-1通過抑制編碼兩種腫瘤抑制因子P16和P19(在人類中是P14)的INK4a-ARF來誘導生長停滯、細胞衰老和凋亡。

表1 Bmi-1蛋白與結直腸癌臨床病理因素的關系

注：a為Fisher確切概率法

本研究發現在結直腸癌原發灶中的Bmi-1的表達水平顯著高于正常黏膜，Bmi-1在原發灶中的高表達與結直腸癌的病理類型、分期及淋巴結轉移相關，提示Bmi-1不僅參與結直腸癌的發生、發展，同時可能也參與淋巴結的轉移，這與國內外許多報道的結果一致。Bmi-1在許多癌灶中存在異常表達，其中就包括結直腸癌、卵巢癌，同時有報道，在shRNA水平下調Bmi-1可以抑制肺腺癌細胞的遷移和轉移[8]，提示Bmi-1不僅是參與惡性腫瘤的發生、發展，同時也參與惡性腫瘤的轉移，但是本研究未發現Bmi-1在卵巢轉移灶中存在異常表達的現象，提示Bmi-1在大腸癌卵巢轉移過程中發揮的作用及作用的機制可能與腫瘤轉移基因的作用機制有所不同。雖然現已明確Bmi-1與P16INK4a和P14ARF抑制因子有關，在結直腸癌中P16INK4a和P14ARF的缺失可能通過該基因5’、CpG島異常甲基化或同源混合性缺失和基因突變的機制被誘導，但是Bmi-1在細胞周期調控中不同的凋亡機制、其在不同微環境中的作用機制以及其是否具有腫瘤轉移基因的作用仍有待于進一步研究。本研究發現Bmi-1在大腸癌卵巢移灶中未見異常表達，但是在原發灶中表達明顯增高，且這部分患者的生存期明顯縮短，說明Bmi-1與伴有卵巢轉移的大腸癌患者的預后相關，可能是結直腸癌重要預后相關因子。

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