博落回內生真菌的分離及其抗菌活性的初步研究

閔長莉，王 允，汪學軍

（1.皖西學院 生物與制藥工程學院，安徽 六安 237012；2.安徽省植物生物技術實訓中心，安徽 六安 237012）

博落回內生真菌的分離及其抗菌活性的初步研究

閔長莉1，2，王 允1，汪學軍2

（1.皖西學院 生物與制藥工程學院，安徽 六安 237012；2.安徽省植物生物技術實訓中心，安徽 六安 237012）

從健康博落回植株中分離內生真菌，用PDA培養基分離純化菌株，結果純化得到19株內生真菌，用瓊脂塊法對獲取的菌株進行抗菌活性篩選，其中有2株博落回內生真菌對指示菌株有抑菌作用，占總分離菌株的10.53%，其中有一株內生真菌具有較強的抑菌活性。

博落回；內生真菌；分離；抗菌活性

博落回（Macleayacordata（Willd）R.Br.）又名號筒桿，系罌粟科植物，全株均可入藥。博落回在我國長江中下游地區廣泛分布，民間作為殺蟲農藥和治療疥癬等在我國有著悠久的歷史。近年來國內外研究結果表明：博落回全草中富含多種生物堿［1］［2］（P133）［3］，這些生物堿多屬于異喹啉衍生物，具有驅蟲、抗菌、消腫、止咳、平喘、鎮痛、抗腫瘤等功效。臨床已用于痔瘡、膿性指頭炎、滴蟲性陰道炎、宮頸糜爛等的治療，效果顯著［4］。作為植物源農藥，博落回有效活性成分的獲得主要從植株中獲取，因此會受到季節的限制，且要大量砍伐博落回，會造成資源不合理利用和物種枯竭。所以，探尋獲取博落回有效活性成分的新途徑成為現今需要解決的問題。

從近年來的研究看，植物體中存在內生真菌是普遍的。植物內生真菌能產生新的天然產物，甚至可以產生與宿主植物相同或相近的代謝產物，因而成為天然產物的重要來源［5］。1993年Stierle等［6］首次從太平洋短葉紅豆杉（Taxomycesandrenae）中分離到可產生抗癌藥物紫杉醇的內生真菌，云南大學郭波、李海燕、張玲琪等人分別從長春花（Catharanthusroseus）、桃兒七（Sinopodophyllumhexandrum）中分離出產長春花堿和鬼臼毒素類似物的內生真菌［7］［8］，而本課題組也從喜樹（CamptothecaacuminataDecne）中分離出產10－羥基喜樹堿的內生真菌［9］［10］。目前，博落回內生真菌的研究還鮮見有報導。因此，開展博落回內生真菌的分離及其代謝產物的研究，無疑將為人類從微生物角度尋找博落回有效活性成分開辟一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 植物材料 博落回植株于2011年8月采自安徽省金寨縣天堂寨風景區，經妥善處理后帶回實驗室供試。

1.1.2 實驗菌株 革蘭陰性細菌：大腸桿菌（Escherichiacoli），銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）；革蘭陽性菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）；均購自中國普通微生物菌種保藏中心。

1.1.3 主要器械 恒溫恒濕培養箱（PYX－150HA），科立儀器；電熱蒸汽壓力消毒器（YX－450），上海三申醫療器械有限公司；潔凈工作臺（SW－CJ－1C（U）），蘇州安泰空氣技術有限公司；照相機（佳能650）。

1.2 培養基配制

1.2.1 內生真菌分離培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基［11］。

1.2.2 指示菌培養基 牛肉膏蛋白胨培養基［11］。

1.3 內生真菌的分離

分別將博落回根、莖、葉在自來水下沖凈后進行表面消毒，先用75%的酒精浸洗2分鐘，無菌水沖洗4次，0.1%升汞消毒2分鐘，無菌水沖洗4次，再用無菌刀片將材料切成小塊后，將上述組織塊置于PDA培養基上于恒溫箱進行28℃恒溫培養，與此同時將上述消毒過程中最后一次沖洗組織塊的無菌水滴在培養基上平行培養，用以檢測博落回植株表面消毒是否徹底。培養3-4天后，及時采用尖端菌絲挑取法，挑取形態不同的菌落接種到新鮮PDA平板上。純化3-5次直到得到形態完全一致的單菌落即純化的內生真菌。

1.4 抗菌實驗

1.4.1 指示菌的活化與菌懸液制備 大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌分別接種于直徑為90mm牛肉膏蛋白胨平板上于37℃活化18h。用接種鏟分別刮取上述四種指示菌菌株至加有玻璃珠30m L無菌生理鹽水中，放置于搖床震蕩30min，使菌體分散均勻，制備成菌懸液后放置于4℃冰箱中備用。

供試菌株的處理：將分離純化得到的內生真菌分別接種于PDA平板上28℃培養7-14d，用直徑6mm的無菌打孔器打孔，制成菌餅。

1.4.2 抑菌實驗 采用瓊脂塊法。分別取1.4.1活化指示菌懸液0.2m L于牛肉膏蛋白胨平板上，用玻璃涂布器涂布均勻后，再把所分離得到的內生真菌菌餅置于指示菌平板中央，培養1-2d；測量并記錄各菌餅抑菌圈的大小。實驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 內生真菌的分離結果

從博落回根、莖、葉材料中共分離到內生真菌19株（結果見表1），從實驗結果可以看出在莖、葉部位分離純化得到的內生數目較多，而根部最少。

表1 博落回內生真菌分離結果

2.2 內生真菌的抗菌活性

對上述19株內生真菌分別進行抑菌活性篩選，結果篩選得到2株內生真菌對供試菌株有抗菌活性，占分離菌株總數的10.53%；其中，由根部分離得到的內生真菌BLH005和由莖部分離得到的內生真菌BLH009對金黃色葡萄球菌均有抑制作用，抑菌圈大小分別為4.21cm、1.15cm；對另外三種指示菌無抑制作用，且內生真菌BLH005具有較強的抑菌活性。

2.3 有抑菌活性內生真菌的形態特征

2.3.1 菌株BLH005 該菌株在PDA平板上生長緩慢，呈放射狀生長，5d后菌落的直徑約為3cm；菌落在5d內顏色純白色，并且在菌落表面有水滴樣滲出物，背面灰白色；7d后菌落表面開始變為灰白色，邊緣不太整齊，菌絲致密；9d后在PDA培養基上背面出現暗紅色色素、正面顏色變化不大（如圖1A所示）。

2.3.2 菌株BLH009 該菌生長緩慢，在生長初期，菌落直徑較小，菌落表面淺綠色，質地緊密，邊緣較整齊。隨著培養時間的延長，菌落直徑逐步變大，至培養5d時，可達1.6cm，且顏色變深為墨綠色，菌落邊緣呈現一個白邊，中央隆起，高度達0.5mm左右（如圖1B所示）。

圖1 菌株BLH005和菌株BLH009在PDA上的形態結構圖A：菌株BLH005；B：菌株BLH009

3 討論

自從Guerin等（1898）從黑麥草中分離出第一株內生真菌以來，關于內生真菌的研究已有100多年的歷史。研究發現它在植物組織中普遍存在，并具有豐富的物種多樣性［12］［13］。到目前為止，人們對博落回內生真菌的研究方面鮮見有文獻報導。因此，開展博落回內生真菌的研究，可以更加全面反映自然界中內生真菌的多樣性，發掘出內生真菌新資源，為進一步篩選博落回內生真菌活性物質奠定基礎。

從近年來的研究看，植物內生真菌具有普遍的抑菌活性［14－16］。本研究從博落回中分離得到的19株內生真菌，其中對金黃色葡萄球菌具有拮抗活性的菌株占到總菌株數的10.53%，也再次印證了這個觀點；并且發現內生真菌BLH005的代謝產物具有較高的抑菌活性。

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A Preliminary Study on Isolation of Endophytic Fungi fromMacleaya
Cordataand Its Antimicrobial Activity

MIN Chang-li1，2，WANG Yun1，WANG Xue-jun2
（1.CollegeofBiotechnologyandPharmaceuticalEngineering，WestAnhuiUniversity，Lu’an237012，China2.AnhuiPlantBiotechnologyTrainingCentre，Lu’an237012，China）

Nineteen endophytic fungal strains were isolated from the healthyMacleayacordataby flat-panel separation.Agar block method was used to obtain the strain for antimicrobial activity screening.The results showed that two endophytic fungi（10.53%of the total strains isolated）had inhibitory activities to the test strains，and a strong inhibitory activity of endophytic fungus was also be found.

Macleaya cordata；endophytic fungi；isolation；antimicrobial activit y

Q932.331

A

1009－9735（2012）02－0004－03

2012－03－13

國家自然科學基金項目（31100019）。

閔長莉（1975－），女，安徽霍邱人，皖西學院生物與制藥工程學院講師，碩士，研究方向：微生物藥物學。