大別山區(qū)葛根黃酮對四氧嘧啶糖尿病模型小鼠糖脂代謝的影響

方士英，徐茂紅，顧宏霞，張小勇，趙克霞，吳 虹，陳曉芳

（皖西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系，安徽六安 237000）

大別山區(qū)葛根黃酮對四氧嘧啶糖尿病模型小鼠糖脂代謝的影響

方士英，徐茂紅，顧宏霞，張小勇，趙克霞，吳 虹，陳曉芳

（皖西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系，安徽六安 237000）

為研究葛根黃酮（RPF）對糖尿病模型小鼠糖脂代謝的影響及其可能的作用機制，采用四氧嘧啶（ALX，220mg／kg）腹腔注射建立糖尿病小鼠模型。RPF連續(xù)灌胃15d后摘眼球取血，分離血清，測定血糖、血清甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶（NOS）水平；取肝、腎臟制成10%勻漿測定其NO和NOS水平；觀察胰腺病理學(xué)形態(tài)變化。結(jié)果顯示RPF能降低ALX誘導(dǎo)的糖尿病模型小鼠血糖、血清和肝臟中NO和NOS。其降糖機制可能與降低血清、肝臟的NO和NOS水平有關(guān)。

葛根黃酮；糖尿??；一氧化氮；一氧化氮合酶

葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根，習(xí)稱野葛［1］（P312－313）。葛根性涼，味甘、辛，歸脾、胃經(jīng)。具有解肌退熱，生津止渴，透疹，升陽止瀉，通經(jīng)活絡(luò)，解酒毒之功效［2］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，RPF可擴張腦血管、冠狀動脈，對高血糖、高血脂和心腦血管疾病均有一定的療效［3］［4］。現(xiàn)已證實，RPF是葛根主要生物活性成分。位于安徽省大別山區(qū)的六安市金寨和霍山縣盛產(chǎn)葛根，相關(guān)企業(yè)正進行產(chǎn)品研發(fā)，因此，本文探討了RPF對ALX糖尿病小鼠血糖的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

昆明種小鼠，♂，體重20g～26g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，皖醫(yī)實動準(zhǔn)字第01號。動物分籠飼養(yǎng)，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為23℃～26℃。

1.2 藥品

RPF：安徽大別山葛業(yè)有限公司提供（含量≥80%）；格列本脲（glibenclamide，GLB）：天津太平洋制藥有限公司，批號：20091203；四氧嘧啶：sigma公司產(chǎn)品，批號：092K2514，臨用前用生理鹽水配制；TG測試盒：南京建成生物工程研究所，批號：20100914；TC測試盒：南京建成生物工程研究所，批號：2011006；葡萄糖測試盒：長春匯力生物技術(shù)有限公司，批號：2011007；考馬斯亮蘭試劑盒：南京建成生物工程研究所，批號：20110402；NO和NOS試劑盒：南京建成生物工程研究所，批號分別為20110330，20110326。

1.3 儀器

L500低速自動平衡離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；UV1200紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；Mettler電子天平，梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司。

1.4 ALX致小鼠糖尿病模型的制備［5］（P1364－1368）

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，禁食不禁水12小時后，將ALX（用生理鹽水配成1.1%濃度）按220mg／kg劑量左下腹腔單次注射。注射后72h測定空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)BG），F(xiàn)BG＞11.1mmol／L者作為糖尿病成功模型［4］。

1.5 動物分組及給藥方案

隨機取正常小鼠10只為空白對照組，取造模成功的50只小鼠隨機分為5組，分別為糖尿病模型組、GLB陽性對照組（2.5mg／kg），RPF小劑量組（250mg／kg）、中劑量組（500mg／kg）、高劑量組（1000mg／kg）。實驗期間各組小鼠均給予普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。糖尿病模型組與空白對照組每日灌胃（ig）相應(yīng)體積的生理鹽水，其余各組動物ig相應(yīng)藥物，每日1次，共15d。

1.6 生化指標(biāo)測定

末次給藥后，小鼠禁食18h后摘除眼球取血，3000r／min離心15分鐘，分離血清。用化學(xué)比色法測定小鼠血清TG、TC、NO和NOS。摘取肝臟和腎臟，制成10%勻漿測定其NO和NOS水平。

1.7 胰腺HE染色

頸椎脫臼處死小鼠，取胰腺組織，用福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，做石蠟切片，每例均進行蘇木素－伊紅（HE）染色。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS11.0軟件包處理，實驗結(jié)果均以（±s）表示，組間顯著性檢驗用t檢驗及相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 RPF對ALX糖尿病小鼠生化指標(biāo)的影響

模型組小鼠血糖與正常組比較，血糖明顯升高且穩(wěn)定，雖然模型組小鼠血糖隨時間的延長會有一定的降低，但不具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明ALX誘導(dǎo)的小鼠糖尿病模型具有一定的穩(wěn)定性。GLB組（2.5mg／kg）和RPF（250、500、1000mg／kg）均能降低ALX誘導(dǎo)的糖尿病模型小鼠的血糖。模型組TG、TC含量與對照組比較均顯著升高，但是各用藥組的TG、TC含量與模型組、對照組比較均無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見表1。

表1RPF對糖尿病小鼠生化指標(biāo)的影響（±s，n＝10）

表1RPF對糖尿病小鼠生化指標(biāo)的影響（±s，n＝10）

與模型組比較：＃P＜0.05；與正常組比較＊P＜0.05

GroupDose（mg／kg）Glucose（mmol／l） TG（mmol／l） TC（mmol／l）Normal 5.64±0.89 1.13±0.23 1.95±0.21 Model 18.7±2.78＊1.99±0.46＊2.25±0.16＊GLB 2.5 3.05±0.63＃1.39±0.35 2.07±0.19 RPF 250 3.67±0.83＃1.73±0.46 2.13±0.40 500 5.26±0.99＃1.61±0.42 2.11±0.33 1000 7.44±0.92＃1.69±0.32 2.10±0.24

2.2 RPF對糖尿病模型小鼠血清、肝臟和腎臟的NO及NOS影響

與對照組比較，模型組小鼠血清、肝臟和腎臟NO及NOS均有明顯上升（P＜0.05）。RPF中、高劑量組能夠降低血清NO及NOS含量，低劑量沒有明顯作用。RPF對肝臟的NO、NOS和腎臟的NO水平有所降低，對腎臟的NOS作用沒有顯著性。結(jié)果見表2。

表2 RPF對糖尿病小鼠血清、肝臟和腎臟NO及NOS的影響（±s，n＝10）

表2 RPF對糖尿病小鼠血清、肝臟和腎臟NO及NOS的影響（±s，n＝10）

與模型組比較：＃P＜0.05；與正常組比較＊P＜0.05

Group dose（mg／kg） Blood Serum（μmol／l）NO NOS Liver（μmol／gprot）NO NOS Kidney（μmol／gprot）NO NOS Normal － 4.24±1.98 17.5±2.96 1.55±0.75 3.19±1.09 0.96±0.42 2.12±0.75 Model － 9.66±3.64＊ 21.5±1.62＊ 2.54±0.92＊ 4.39±1.07＊ 2.04±0.76＊ 5.18±1.56＊GLB 2.5 6.49±1.88 19.9±1.50 2.42±1.53 2.59±1.20 1.28±0.62 4.10±0.98 RPF 250 5.74±2.63 21.4±1.03 1.68±0.86＃ 2.85±0.70＃ 1.62±0.56 4.20±1.14 500 5.90±2.11＃ 18.8±0.74＃ 1.45±0.62＃ 2.71±0.60＃ 1.42±0.90＃ 4.14±0.39 1000 3.97±1.77＃ 18.6±1.76＃ 1.31±0.56＃ 2.62±0.63＃ 1.35±0.94＃4.00±1.20

2.3 RPF對糖尿病小鼠胰腺病理形態(tài)學(xué)的影響

對照組A組小鼠的胰腺組織形態(tài)正常，胰島較規(guī)則，類圓形。模型組B組小鼠胰島細(xì)胞可見不同程度的萎縮，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞大小不等，結(jié)構(gòu)模糊，胞漿腫脹或胞漿減少，并有空泡變性，胰島外圍鞘破壞。陽性對照組C組與RPF的D、E、F組小鼠的胰島細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)略有所改善，胞漿空泡變性減少，但部分細(xì)胞腫脹，細(xì)胞顯示大小不等，細(xì)胞排列略為整齊，與模型組比較有所改善。見圖1。

3 討論

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是以持續(xù)高血糖為基本特征的一種綜合性病癥，隨著病程的延長，會導(dǎo)致眼、腎、神經(jīng)、血管、心臟和皮膚等組織器官慢性并發(fā)癥的發(fā)生，甚至危及生命［6］［7］。糖尿病現(xiàn)代治療的五個要點包括飲食控制、運動療法、血糖監(jiān)測、藥物治療和糖尿病健康教育［8］（P280）。降血糖的化學(xué)藥品由于毒副作用大，不宜長期服用，并且伴隨不適癥狀［9］。因此，葛根與西藥結(jié)合治療糖尿病有發(fā)展前景和現(xiàn)實意義。

圖1 RPF對ALX糖尿病模型小鼠胰腺病理組織學(xué)的影響（HE×200）

糖尿病主要由胰島素分泌的絕對或相對缺乏所引起。ALX是一種特異性的胰島B細(xì)胞毒劑，在體內(nèi)可選擇性被胰腺B細(xì)胞吸收，激活自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生過量的自由基。過量自由基能夠直接破壞B細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致胰島B細(xì)胞的損傷和壞死，胰島素水平降低而出現(xiàn)高血糖等糖尿病癥狀［10］［11］。

本實驗用ALX誘導(dǎo)小鼠糖尿病模型，經(jīng)RPF中、高劑量組治療15d血糖有明顯下降，表明RPF有良好的降血糖作用。從胰島細(xì)胞形態(tài)分析，RPF有恢復(fù)糖尿病小鼠胰腺形態(tài)結(jié)構(gòu)的作用。

體內(nèi)的NO由一氧化氮合酶（Nitric oxide synthases，NOS）催化L－精氨酸（L－Arg）產(chǎn)生。在生理情況下，NO主要作為生物信使分子和細(xì)胞保護劑而發(fā)揮保護作用［12］。在病理狀態(tài)下，炎癥刺激激活誘生型NOS表達和促進NO持續(xù)大量釋放，NO在炎癥級聯(lián)反應(yīng)中起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，尤其在炎癥反應(yīng)的發(fā)生和信號傳導(dǎo)方面。由此途徑產(chǎn)生的NO往往表現(xiàn)有細(xì)胞毒作用，高水平的NO可損傷線粒體、含鐵硫蛋白酶，亦可引起DNA的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。糖尿病及其并發(fā)癥對機體所致?lián)p傷，NO在其中起重要作用［13］。本實驗研究表明，ALX誘發(fā)的糖尿病小鼠血清、肝、腎NO、NOS含量明顯升高，表明ALX損傷胰島細(xì)胞的途徑可能與生成過量的NO、NOS有關(guān)。RPF能降低糖尿病小鼠肝、腎組織的NO、NOS含量，減輕NO的細(xì)胞毒作用，提示RPF對糖尿病小鼠有一定的保護作用，其保護作用機制可能與其降低NO和NOS的含量有關(guān)。

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Effects of Radix Pueraria Flavonoids in Da Bie Shan Zone on Blood Glucose and Lipid Level of Diabetic Mice Induced by Alloxan

FANG Shi－ying，XU Mao－h(huán)ong，GU Hong－xia，ZHANG Xiao－yong，ZHAO Ke－xia，WU Hong，CHEN Xiao－fang

（DepartmentofPharmacy，WestAnhuiVocationalHealthUniversity，Lu’an237000，China）

To evaluate the effects of Radix Pueraria Flavonoids on blood glucose and lipid level of diabetic mice induced by alloxan and study the hypoglycemic activity of Radix Pueraria Flavonoids and the mechanism.Injecting alloxan（220mg／kg）into its abdominal cavity to set animal model of diabetes.After 15d administration of RPF，blood glucose were determined and blood serum was drawn to determine TG，TC，NO and NOS.Liver and kidney were drawn to determine NO and NOS.Pancreatic pathology was studied with morphological method.Compared with diabetic model group，the results show that RPF could decrease the blood glucose level and lower NO，NOS in blood serum and liver.The mechanisms of hypoglycemic activity of RPF may be related to lowering NO and NOS in blood serum and liver.

Radix Pueraria Flavonoids；diabetes mellitus；nitrogen monoxide；nitric oxide synthase

R96

A

1009－9735（2012）02－0007－03

2012－02－20

安徽省教育廳2011年度高校省級自然科學(xué)研究項目（KJ2011B203）。

方士英（1964－），男，安徽壽縣人，皖西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院副教授，碩士，研究方向：中藥藥理和抗炎免疫藥理學(xué)。