柄海鞘共附生細菌的分離培養與系統發育多樣性研究＊

苗婷婷，邢 翔，杜宗軍，陳冠軍

（山東大學 威海分校 海洋學院，山東 威海264209）

柄海鞘共附生細菌的分離培養與系統發育多樣性研究＊

苗婷婷，邢 翔，杜宗軍，陳冠軍＊

（山東大學 威海分校 海洋學院，山東 威海264209）

通過純培養和16SrRNA基因序列的相似性比對，并構建系統發育樹對威海海域柄海鞘共附生細菌的多樣性進行了研究。用2216E培養基從柄海鞘樣品中分離到78株細菌，通過形態學特征和TCBS培養基選擇性篩選后，選取30株具有代表性的菌株進行了16SrRNA基因測序和基于16SrRNA基因序列的系統發育多樣性分析。結果表明，30株菌株分別屬于細菌域的4個系統發育類群（Actinobacteria，Bacteroidetes，Firmicutes，Groteobacteria）的11個科，11個屬。根據16SrRNA基因序列，大多數菌株與其系統發育關系最密切的模式菌株之間存在一定的遺傳差異（16SrRNA基因序列相似性為91.82% ～98.93%）。其中菌株HQW7，HQYD1，HQWD4，HQE1和HQE2與相關模式菌株的16SrRNA基因最高相似度僅分別為91.82%，92.51%，92.99%，93.52%，93.87%，這5株菌可能代表新的分類單元。威海海域柄海鞘共附生細菌存在著較為豐富的物種多樣性和系統發育多樣性，并可能存在新的物種。

柄海鞘；共附生細菌；16SrRNA基因；系統發育分析；細菌多樣性

海洋中的微生物分布非常廣泛，有的自由生活在海水中，有的存在于海底沉淀物或海泥的表面，還有一部分與海洋動植物處于共生、共棲、寄生或附生的關系。共附生細菌可能在清除宿主代謝廢物［1］和為宿主提供生物活性物質［2－4］等方面扮演著重要角色。由于共附生菌長期與宿主共進化，往往擁有特殊的代謝途徑，故很有可能產生結構全新的生理活性物質，為研究與開發微生物制品和微生物藥物提供了寶貴的源頭線索，因此許多研究者對于利用共附生海洋微生物作為天然生物制品的來源產生相當大的興趣［5］。從海洋生物分離出的具有重要生物功能的次級代謝產物，也往往是由附生于其上的微生物產生的。在許多情況下，若要得到大量宿主用于生產藥物是非常困難的，這也是其商業化生產的障礙。而細菌則不同，大規模的培養就可以保證共生菌穩定的生產量［6］。而且微生物具有生長周期短、代謝易于控制、菌種易于選育等優勢，因此共生微生物資源的利用和開發應無來源之憂。因此，從共附生細菌中分離生物活性物質就能夠越過這個障礙，免除了從自然環境中收獲大量宿主的需要。這樣，既保護了環境也降低了商業化生產的成本。

海洋無脊椎動物的體表和體內存在著大量的微生物，它們與海洋無脊椎動物之間存在著高度特異性的共附生關系。目前，海洋無脊椎動物的研究對象主要集中在海綿、海葵、珊瑚和一些腸腔動物。Kennedy等［7］對?？哺缴毦鷧^系以及具有抗菌活性的細菌進行了研究。Xie等［8］指出從?？①O貝等分離到的活性菌株數高于從其他動物中分離的活性菌數。鄭立等［9］的研究證明了無脊椎動物體表的共附生細菌對于赤潮藻具有抑制作用。近幾年，在海鞘中也發現了許多結構新穎、活性獨特的化合物［10－12］，引起了許多研究人員的高度重視，已經逐漸成了海洋天然產物化學研究的熱點，海鞘也成了除海綿之外人類獲取有顯著生理活性物質的重要海洋生物資源。由于海洋生物中的許多活性化合物是由其共附生微生物代謝產生的，因此采集海鞘共附生微生物資源，研究其系統發育多樣性，將可以為海洋活性化合物開發提供新的源頭資料。

本研究報道了采用純培養法和基于16SrRNA基因序列的系統發育分析對威海近海海域柄海鞘中可培養共附生細菌的系統發育多樣性的研究結果，以期為相關微生物資源的研究、保護、開發和利用打下一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 主要試劑

PCR引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。細菌基因組DNA抽提試劑盒，PCR常規操作用試劑和酶均購自生工生物工程（上海）有限公司。DNA Marker購于寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 培養基

2216E海洋細菌培養基：蛋白胨5g，酵母粉1g，檸檬酸鐵0.01g，瓊脂15～18g，陳海水1L，0.1g／L NaOH 調pH 值至7.2～7.6，121℃，20min滅菌。

TCBS培養基：成品TCBS（北京 陸橋）培養基加入0.02g／L的NaCl，煮沸后倒平板。

1.2 樣品的采集與菌株的分離

1.2.1 樣品采集

柄海鞘（Styela clava）樣品于2009－09采自山東威海近海（37°37′14″N，122°01′05″E）。采到的柄海鞘立即保存到裝有海水的標本袋里，密封（防止柄海鞘與空氣直接接觸），迅速帶回實驗室。在實驗室超凈工作臺中及時處理。

1.2.2 樣品處理

將采集的柄海鞘用無菌海水反復沖洗表面后，在超凈工作臺中解剖，分別取其胃腸消化系統、咽部和生殖腺稱重，用無菌海水沖洗后研磨成漿，用無菌海水按照l0－1到10－6的比例進行梯度稀釋。取柄海鞘體腔液500μL，用無菌海水按照l0－1到10－6的比例進行梯度稀釋。在2216E［12］固體培養基上涂布接種，每個板接種0.1mL，在25℃下培養3～5d。用相同的培養條件分離純化所得的菌株。

1.2.3 菌株的分離純化與篩選

挑取平板上的單菌落，在2216E平板上進行劃線分離，菌種達到純培養以后，在－70℃冰箱進行菌種的長期保藏。將純培養物接種到TCBS培養基上進一步觀察其生長狀況。

1.3 細菌16SrRNA基因序列測定與系統發育分析

1.3.1 細菌DNA的抽提

按照DNA柱式抽提試劑盒的相關說明操作進行抽提，0.8%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.3.2 細菌16SrRNA基因的擴增

利用50ng／μL的DNA作為模板對16SrRNA基因進行擴增，PCR引物為通用引物：正向引物27F：5′－AGAGTTTGATC（C／A）TGGCTCAG－3′；反向引物1492R：5′－TACGG（C／T）TACCTTGTTACGAC－3′。PCR反應體系：模板，1μL；正，反引物各1μL；2×PCR Mix Kit，25μL；Taq酶，1μL；ddH2O，21μL。PCR反應條件：94℃預變性6min；94℃變性45s，55℃復性45s，72℃延伸90s，35個循環；最后72℃溫育8 min。PCR產物經電泳檢測后直接送至測序公司進行測序或進行克隆后測序。

根據測序結果，運用Blast程序與數據庫中已存在的細菌16SrRNA基因序列進行相似性比較分析；序列的比對及系統發育分析采用MEGA（4.0）軟件。

1.4 Shannon－winner多樣性指數

本研究采用16SrRNA基因序列相似性小于97%的菌株屬于不同物種的歸類原則［13］，采用Shannonwinner指數（H）和均勻度指數（E）估算多樣性。

式中，S為菌種數；Pi為第i種的多度比例，Pi＝ni／N；n為第i種的菌株數；N為所有菌株數的總和。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離

根據菌落大小、形態、顏色等特征，挑取分離平板上的單菌落進行劃線分離純化，用顯微觀察法檢查純化情況，最終從本次采集的樣品中分離到78株純培養物，其中55株細菌能夠在TCBS培養基上生長。TCBS培養基，即硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養基，主要用于弧菌科細菌的分離培養。能夠在TCBS培養基上生長說明本次試驗中的55株細菌屬于弧菌科。

2.2 柄海鞘相關微生物類群的多樣性

通過菌落形態、細胞顯微形態觀察以及TCBS培養基培養實驗結果去冗余，最終從78株純培養物中選擇30株（其中有7株為能夠在TCBS培養基上生長的菌株）并進行測序和基于16SrRNA基因序列的系統發育多樣性分析。16SrRNA基因PCR擴增后電泳結果見圖1，基因片段大小約為1 500bp。30株分離菌株的16SrRNA基因序列提交GeneBank數據庫進行注冊，獲得注冊號為JF721968～JF721997。

一般認為，根據16SrRNA基因序列，菌株間同源性在93%～95%，可以認為屬于不同的屬［14］；同源性大于95%，可以認為屬于同一屬；16SrRNA序列同源性大于97%，可以認為屬于同一個種?；?6SrRNA基因的系統發育分析見圖2（系統發育樹）。

圖1 16SrRNA 基因PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarosegel electrophoresis of PCR products of 16SrRNA gene

16SrRNA基因序列分析表明，30個分離菌株屬于細菌域的4個系統發育類群（表1）：放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌綱（Proteobacteria），其中包括11個科（Alteromonadaceae，Bacillaceae，Flammeovirgaceae，Flavobacteriaceae，Halomonadacea，Micrococcacea，Pseudomonadaceae，Psychromonadaceae，Shewanellaceae，Staphylococcaceae，Vibrionaceae）、11個屬（Agarivorans，Arthrobacter，Bacillus，Flammeovirga，Halomonas，Shewanella，Staphylococcus，Tenacibaculum，Pseudomonas，Psychromonas，Vibrio）。其中，變形菌綱菌株都屬于γ－變形菌綱，占分離菌株的絕大部分比例（22株，73.3%），其次是Bacteroidet菌門（4株，13.3%），Firmicutes菌門（3株，10%），Actinobacteria菌門（1株，3.3%）。

表1 柄海鞘可培養細菌與其系統發育關系最密切的典型菌株間的系統發育關系Table 1 Closest phylogenetic neighbors of strains isolated from Styela clava based on 16SrRNA sequence analysis

圖2 基于16SrRNA基因序列構建的柄海鞘共附生可培養細菌的系統發育樹Fig.2 Neighbor－Joining tree constructed based on 16SrRNA gene sequence analysis showing the phylogenetic relationships among strains isolated from Styela clava and related taxa

2.3 物種與遺傳多樣性

按16SrRNA基因序列相似性小于97%的菌株是屬于不同物種的歸類原則，30個分離菌株可以歸為23個物種。柄海鞘相關可培養細菌的Shannon－winner多樣性指數（H）為4.26，均勻度指數（E）為0.97，表明其具有較高的物種多樣性和均勻度。除了2株（HQF5和HQWB9）分別與其相關的已知物種的典型菌株的16SrRNA基因序列相似性為100%外（表1），部分分離菌株與其相關的已知物種的典型菌株的16S rRNA基因序列相似性在91.82%～98.93%之間，說明部分菌株與其系統發育關系密切的相關菌株之間存在一定的遺傳差異。

值得指出的是，菌株HQW7、HQYD1、HQWD4、HQE1和HQE2與模式菌株的16SrRNA基因系列存在較大差異，最高相似度僅分別為91.82%，92.51%，92.99%，93.52%，93.87%，這5株菌可能代表新的分類單元。目前這些細菌的新種鑒定工作正在進行中。

3 討 論

本研究采用細菌純培養以及基于16SrRNA基因序列的系統發育分析對威海海域柄海鞘的共附生細菌的多樣性進行了研究。本次試驗共獲得78株純培養物，通過TCBS培養基的選擇性篩選可知，柄海鞘共附生細菌中有很大比例的菌株屬于弧菌屬（55株，70.5%）。作為近海河口環境中的微生物區系的主要成員，弧菌廣泛分布于半咸水、河口、海洋的水體和沉積物中?；【诤Ｑ蟓h境中占據優勢地位，除在營養物的循環中起著非常重要的作用外，弧菌還是魚、蝦、軟體動物腸道內可培養細菌種的優勢菌群，在消化和營養方面可能起著非常重要的作用［15－16］。于德華等［17］在調查研究青島近岸不同環境中的海洋弧菌時發現，在海水、沉積物、魚類和藻類等海洋生物表面，弧菌科都是優勢種群，在魚體表面甚至達到83.1%，在工業污染區沉積物中也占39.5%，其它環境中都達到50%左右甚至更多。在無污染海域，弧菌屬在細菌區系中的比例為10%～14%，在海水養殖密集區的比例在6%～7.5%之間，在魚體表面達47.7%，在工業污染區的比例為2.6%～5%。本次試驗結果與此相符。

Webster等［18］等研究了海綿（Rhopaloeides odorabile）共附生細菌的系統發育多樣性，在他們分離并測序的34株細菌中，放線菌門菌株占30%，γ－變形菌綱菌株占41%。Huang等［19］在調查硇洲海域馬糞海膽可培養細菌多樣性時發現，厚壁菌門菌（58.8%）是其中占優勢的微生物類群，其次是γ－變形菌綱（26.5%）。Xiao等［20］發現海葵中可培養細菌中厚壁菌門也是優勢菌群，占所分離細菌總數的40.5%，γ－變形菌綱菌株占33.3%。本研究結果也表明γ－變形菌綱是柄海鞘共附生細菌的優勢菌群，這與其它海洋無脊椎動物具有相似之處。

用于系統發育分析的30株菌歸屬4個系統發育群11個科11個屬，可以分為23個物種，大多數菌株與其系統發育關系最密切的已知物種的典型菌株之間存在一定的遺傳差異（16SrRNA基因序列相似性為91.82%～98.93%），且發現5株菌 HQW7、HQYD1、HQWD4、HQE1和 HQE2與模式菌株的16SrRNA基因相似度較低，可能代表新的分類單元。上述結果揭示了柄海鞘可培養細菌的多樣性。

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Isolation and Phylogenetic Analysis of Associated Bacteria From theStyela clava

MIAO Ting－ting，XING Xiang，DU Zong－jun，CHEN Guan－jun
（Marine college of Shandong University at Weihai，Weihai 264209，China）

Associated bacteria were isolated from Styela clava collected from the coast of Weihai，China.They were cultured by using conventional culture－dependent method and investigated by using phylogenetic analysis based on 16SrRNA gene sequence comparisons.The 78isolates were selected from samples on marine 2216medium （Difco）.Based on morphological characters and weather growing on TCBS selective medium，we selected 30strains for molecular phylogenetic study using 16SrRNA gene sequences.Our results showed that 30isolates were members of 11genera of 11families in 4major phylogenetic groups（Actinobacteria，Bacteroidetes，Firmicutes，Proteobacteria）.Most of the strains had certain genetic differences between the closely known type strains（16SrRNA gene sequence similarity were 95.57%～99.88%）.The lower similarity suggested that at least 5strains represented new species.The results presented above showed that there were abundant species diversity and phylogenetic diversity of bacteria isolated fromStyela clava.

Styela clava；associated bacteria；16SrRNA gene；phylogenetic analysis；bacterial diversity

April 15，2011

Q938.1

A

1671－6647（2012）01－0111－08

2011－04－15

國家自然科學基金重點項目——渤海中南部底棲生物生產過程與生物多樣性集成研究（40730847）；山東大學自主創新基金項目——海洋微生物的資源采集及其次生代謝產物研究（IIFSDU）

苗婷婷 （1988－），女，山東濟寧人，研究生，主要從事海洋生物學方面研究.E－mail：miaotingting456＠163.com

＊通訊作者，教授，博士生導師，主要從事纖維素的微生物降解、微生物生理生化及酶學方面研究.E－mail：guanjun＠sdu.edu.cn

（王佳實 編輯）