應(yīng)用移植瘤胃癌模型探討Tregs對(duì)DC-CIK細(xì)胞抗腫瘤活性的影響

劉愛華 張春艷 劉興田 王靜波 王 茜 邵春月

(1.泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 泰安 271000；2.泰安市中心醫(yī)院分院 泰安 271000)

近年來，惡性腫瘤的過繼性免疫治療取得了令人鼓舞的效果，研究適合于該療法的新型免疫活性細(xì)胞目前仍是一大熱點(diǎn)。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer, CIK)是一類新型抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞，不僅直接殺傷腫瘤細(xì)胞，還能增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能[1]。樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DCs)作為機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞(APC)，能激發(fā)初次和繼發(fā)性T細(xì)胞免疫應(yīng)答，并且誘發(fā)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。DC和CIK細(xì)胞作為腫瘤免疫治療的兩個(gè)重要部分，兩者聯(lián)合治療惡性腫瘤，無疑會(huì)起到協(xié)同抗腫瘤作用[2]。腫瘤局部存在多種類型的免疫抑制細(xì)胞，通過某些作用機(jī)制來抑制免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。其中CD4+CD25+T細(xì)胞是具有抑制性免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞群，能抑制DC-CIK細(xì)胞的抗腫瘤活性，我們的體外研究結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。為進(jìn)一步研究CD4+CD25+T細(xì)胞在體內(nèi)對(duì)DC-CIK細(xì)胞殺傷活性的影響，我們構(gòu)建了胃癌移植瘤模型，研究免疫磁珠分選去除CD4+CD25+T細(xì)胞的DC-CIK細(xì)胞的抗腫瘤殺傷活性，以評(píng)價(jià)CD4+CD25+T細(xì)胞對(duì)DC-CIK細(xì)胞體內(nèi)抑瘤活性的影響，為其臨床應(yīng)用和療效評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞 6周齡BALB/ c裸鼠，質(zhì)量是18～20 g， 雌雄兼用， 購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，SPF 條件飼養(yǎng)。SGC-7901胃癌細(xì)胞株購自凱基公司。

1.1.2標(biāo)本來源 外周血來源于本院健康自愿者。

1.1.3主要試劑 抗CD3單克隆抗體購自eBioscience公司；人rhIL-4、rhIL-2、rhIL-1a、rhGM-CSF購自PeproTech公司；rhINF-γ購自上海克隆生物技術(shù)公司；Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)笊镏破饭荆籇MEM培養(yǎng)液購自Gibbco公司；FITC標(biāo)記鼠抗人CD3、PE標(biāo)記鼠抗人CD56單克隆抗體及同型對(duì)照IgGα1購自美國BD公司；CD4+CD25+T細(xì)胞分選試劑盒購自德國Miltenyi公司；HE染色購自上海江萊生物科技有限公司

1.2方法

1.2.1腫瘤抗原蛋白的制備 取對(duì)數(shù)生長期SGC-7901胃癌細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化液消化，PBS洗滌3次，制成混懸液，調(diào)細(xì)胞濃度為5×107/ml，裝入凍存管中，放入液氮中保存10 min，取出立即置入37 ℃水浴箱中融化，反復(fù)凍融4次，10000 rpm離心10 min，收集上清液，用紫外分光光度計(jì)檢測抗原蛋白濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2CD4+CD25+T細(xì)胞的分選 無菌分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml，應(yīng)用免疫磁珠分選法分選外周血單個(gè)核細(xì)胞中的CD4+CD25+T細(xì)胞。按1×107細(xì)胞加入10ul相應(yīng)抗體的比例加入抗體，先應(yīng)用陰性分選法獲得CD4+細(xì)胞，而后通過陽性分選分離CD25+細(xì)胞。

1.2.3體外誘導(dǎo)DC、CIK細(xì)胞 無菌分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為5×106/ml， 37 ℃ 5% CO2孵育2 h，貼壁細(xì)胞加人GΜ-CSF 100 U/ml、rhIL-4 50 ng/ml，置于37 ℃ 5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每3天換液。第6天加入腫瘤抗原沖擊，按50 μg/ml濃度加入DC細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)3天誘導(dǎo)DC成熟。懸浮細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)要求分兩組：DC-CIK組(常規(guī)單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)分化的DC-CIK細(xì)胞)和DC-CIK-Treg/del組(免疫磁珠分選去除CD4+CD25+T細(xì)胞的單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)分化的DC-CIK細(xì)胞)，培養(yǎng)第1 天加入INF-γ 1000 U/ml，37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，第2 天加入抗CD3單克隆抗體50 ng/ml、rhIL-2 1000 U/ml、rhIL-1a 2 ng/ml，每3天換液并計(jì)數(shù)。培養(yǎng)至第9天的成熟DC加入到CIK細(xì)胞中(DC∶CIK=1∶10)，共同培養(yǎng)至第15天。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型 分別取不同培養(yǎng)階段的DC-CIK組和DC-CIK-Treg/del組的細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度為1×106，每管加入100 μl，分別加入10 μl CD3-FITC、CD56-PE、同時(shí)加入IgGα1同型對(duì)照，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，PBS洗滌2次，流式細(xì)胞儀檢測，Cell Quest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5胃癌移植模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 取對(duì)數(shù)生長期的SGC-7901胃癌細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化液消化， PBS洗滌3次，混懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107/ml，BALB/ c 裸鼠右肩背部皮下注射0.2 ml腫瘤細(xì)胞懸液，當(dāng)腫瘤長徑達(dá)到5 mm時(shí)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配對(duì)分為DC-CIK組、DC-CIK-Treg/del組及對(duì)照組3組，每組10只。生理鹽水懸浮細(xì)胞，并調(diào)細(xì)胞濃度為2×108/ ml，于小鼠尾靜脈注射DC-CIK組、DC-CIK-Treg/del組DC-CIK細(xì)胞，劑量均為0.2 ml，對(duì)照組注射同等劑量的生理鹽水。隔日注射1次，共6次。

1.2.6移植瘤生長情況觀察 注射DC-CIK細(xì)胞后每日觀察小鼠活動(dòng)情況和精神狀態(tài)，用卡尺每3天測量一次腫瘤大小，按照公式計(jì)算腫瘤的體積( V= a×b2/ 2，其中a代表腫瘤長徑，b代表腫瘤寬徑)；第5周將裸鼠頸椎脫臼處死，剝離腫塊，用電子天平稱瘤重，并按照公式計(jì)算抑瘤率。 抑瘤率(%)= ( 1- T/C) ×100% (式中T：實(shí)驗(yàn)組平均瘤重量，C：對(duì)照組平均瘤重量)。

1.2.7腫瘤組織病理學(xué)檢查 腫瘤剝離后，置于10%中性甲醛溶液中固定，然后由低濃度到高濃度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，多點(diǎn)切片，二甲苯脫蠟，HE染色，顯微鏡下觀察腫瘤標(biāo)本組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1培養(yǎng)前去除CD4+CD25+T細(xì)胞對(duì)DC-CIK的擴(kuò)增及表型的影響 經(jīng)培養(yǎng)的CIK細(xì)胞獲得大量增殖，與特異性抗原致敏的DC細(xì)胞共培養(yǎng)后，CIK細(xì)胞具有更高的增殖活性，15天左右達(dá)到增殖高峰。培養(yǎng)15天的DC-CIK-Treg/del組的擴(kuò)增倍數(shù)為59.80±6.01高于DC-CIK組的擴(kuò)增倍數(shù)46.31±6.21(t=5.39，P<0.05)。

CIK細(xì)胞是一組異質(zhì)細(xì)胞群，主要的效應(yīng)細(xì)胞是CD3+CD56+T細(xì)胞，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，CIK細(xì)胞中CD3+CD56+雙陽性細(xì)胞所占的比例逐漸升高。流式細(xì)胞儀檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞、DC-CIK組及DC-CIK-Treg/del組CD3+CD56+T細(xì)胞所占百分比含量，繪制生長曲線。圖1。

圖1 DC-CIK組與DC-CIK-Treg/del組CD3+CD56+T細(xì)胞生長曲線

2.2移植瘤生長情況觀察 對(duì)照組小鼠腫瘤體積持續(xù)增大，2周后腫瘤生長明顯加快，部分腫瘤中心出現(xiàn)壞死、潰瘍，小鼠活動(dòng)明顯減少，精神萎靡，食量減少。與對(duì)照組相比，治療組兩組裸鼠腫瘤體積增長緩慢，且小鼠活動(dòng)、食量有所增多，尤其是DC-CIK-Treg/del組最為明顯。

2.3培養(yǎng)前去除CD4+CD25+T細(xì)胞對(duì)DC-CIK細(xì)胞體內(nèi)抑瘤活性的影響 通過相同細(xì)胞數(shù)量、相同時(shí)間及相同頻率治療后，治療組兩組腫瘤體積明顯小于對(duì)照組，且DC-CIK-Treg/del組抑制作用尤為明顯(P<0.05)。圖2。治療后5周將裸鼠頸椎脫臼處死，剝離腫塊，稱得瘤體重量顯示，治療組兩組瘤體重量明顯低于對(duì)照組，并且DC-CIK-Treg/del組瘤體重量低于DC-CIK組(P<0.05)。表1。

圖2 DC-CIK組及DC-CIK-Treg/del組細(xì)胞治療后移植瘤生長曲線

表1 DC-CIK組及DC-CIK-Treg/del組細(xì)胞治療后腫瘤重量的變化

2.4腫瘤組織病理學(xué)改變 HE染色可見對(duì)照組腫瘤細(xì)胞呈低分化狀態(tài)，致密排列，細(xì)胞核呈圓形和橢圓形，分裂像多見，染色質(zhì)豐富，胞質(zhì)較少，其中有一些粘液空泡( 圖3A )。DC-CIK細(xì)胞輸注后，引起腫瘤組織細(xì)胞反應(yīng)，可見腫瘤細(xì)胞明顯減少，間質(zhì)內(nèi)有大量組織細(xì)胞、淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞浸潤(圖3B)；而DC-CIK-Treg/del組可見部分腫瘤細(xì)胞壞死( 圖3C) 。

A：腫瘤對(duì)照組；B: DC-CIK組； D：DC-CIK-Treg/del組

圖3 腫瘤組織病理學(xué)切片( HE×200)

3 討 論

腫瘤的免疫治療不僅需要足夠量的免疫效應(yīng)細(xì)胞的活化，而且要有效地打破免疫耐受。Tregs是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型免疫抑制細(xì)胞，能抑制T細(xì)胞對(duì)外源和自身抗原的免疫反應(yīng)，在防治自身免疫性疾病發(fā)生的同時(shí)也導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞的免疫耐受[3]。正常情況下，CD4+CD25+T細(xì)胞占外周血CD4+細(xì)胞的5%-10%，而在眾多腫瘤患者外周血、腫瘤浸潤淋巴結(jié)及局部腫瘤組織中CD4+CD25+T細(xì)胞所占的比例明顯增加，其比率的升高與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，對(duì)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)起負(fù)調(diào)節(jié)作用[4]。CD4+CD25+T細(xì)胞通過細(xì)胞間直接接觸和分泌抑制性細(xì)胞因子，如TGF-β轉(zhuǎn)化生長因子、IL-10等方式抑制CD4+、CD8+效應(yīng)性T細(xì)胞的激活和表達(dá)，阻斷CD4+CD25- T細(xì)胞分泌IL-2，使IL-2介導(dǎo)的效應(yīng)性T細(xì)胞處于低增殖和低反應(yīng)性狀態(tài)[5,6]；同時(shí)它可以抑制具有細(xì)胞毒性功能的NK細(xì)胞以及NKT細(xì)胞的增殖。由于CD4+、CD8+T細(xì)胞是機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答過程中的主要效應(yīng)細(xì)胞，因此，CD4+CD25+T細(xì)胞的免疫抑制功能降低了患者的抗腫瘤免疫應(yīng)答，有利于腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

研究表明，在局部抗腫瘤免疫中，效應(yīng)性T細(xì)胞處于與腫瘤相互作用的最前沿，作為機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答過程中的主要效應(yīng)細(xì)胞CD4+、CD8+T細(xì)胞，大多數(shù)聚集在腫瘤周圍或其間質(zhì)中，在腫瘤內(nèi)明顯降低，而Tregs的數(shù)量在腫瘤組織中顯著高于癌旁組織，并且呈簇叢狀分布，與效應(yīng)性T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)[7]。在腫瘤的免疫治療過程中，有效調(diào)節(jié)Tregs的數(shù)量和功能，對(duì)于提高治療效果可以起到重要作用。實(shí)驗(yàn)證明，在B16黑色素瘤小鼠中，去除CD25+T細(xì)胞可以使小鼠腫瘤生長減慢。因此，如何在更大程度上減少Tregs對(duì)患者免疫功能抑制的影響，獲得更好的抗腫瘤免疫治療效果，成為腫瘤生物治療中一個(gè)需要重點(diǎn)解決的問題。

CIK細(xì)胞是人外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外多種細(xì)胞因子(如INF-r、CD3McAb、rhIL-2、rhIL-1a等)共同培養(yǎng)后獲得。在體外誘導(dǎo)分化過程中，一些非活性細(xì)胞在多種細(xì)胞因子的共同刺激下，激活為有細(xì)胞毒作用的CIK細(xì)胞，其主要細(xì)胞成分是CD3+CD56+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞，因此具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和自然殺傷細(xì)胞(NK)的非主要組織相容性復(fù)合體(MHC)限制性殺瘤的優(yōu)點(diǎn)[8-10]。和以往的淋巴因子激活的殺傷(LAK)細(xì)胞、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)及CD3單克隆抗體激活的殺傷(CD3-AK)細(xì)胞相比，具有更高的增殖能力和更強(qiáng)的抗腫瘤殺傷活性。而且在向腫瘤區(qū)域遷移和浸潤腫瘤組織的能力方面CD3+CD56+NKT細(xì)胞具有明顯的優(yōu)勢，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。而且CIK細(xì)胞與DC共培養(yǎng)可使CIK細(xì)胞溶瘤活性顯著增強(qiáng)，對(duì)靶細(xì)胞的殺傷更具特異性，目前已經(jīng)應(yīng)用于多個(gè)系統(tǒng)的腫瘤治療并取得了一定的臨床療效[11]。但其中含有的CD4+CD25+T細(xì)胞可能對(duì)DC-CIK細(xì)胞中的CD3+CD56+細(xì)胞、CD3+CD8+細(xì)胞及NK細(xì)胞的功能具有抑制作用，從而抑制了DC-CIK的抗腫瘤活性。我們的體外研究也發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)用DC-CIK細(xì)胞抗腫瘤免疫的同時(shí)，去除CD4+CD25+T細(xì)胞成分可以明顯提高DC-CIK細(xì)胞的增殖能力和殺瘤活性。為了進(jìn)一步研究其在體內(nèi)對(duì)DC-CIK細(xì)胞抗腫瘤作用的影響，我們靜脈輸注去除和未去除CD4+CD25+T細(xì)胞成分的DC-CIK細(xì)胞給移植瘤胃癌動(dòng)物模型，觀察對(duì)裸鼠體表移植瘤的抑制作用，發(fā)現(xiàn)輸注DC-CIK 細(xì)胞后腫瘤體積、重量明顯低于對(duì)照組，而去除CD4+CD25+T細(xì)胞成分DC-CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤的抑制作用明顯高于未去除組DC-CIK細(xì)胞。腫瘤組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組腫瘤細(xì)胞呈低分化狀態(tài)，細(xì)胞致密排列，胞核大，分裂像多見，胞質(zhì)較少，其間含有一些粘液空泡；尾靜脈注射DC-CIK細(xì)胞后，腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度的改變，表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞明顯減少，引起腫瘤組織細(xì)胞反應(yīng)，可見大量組織細(xì)胞、淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞浸潤；而去除CD4+CD25+T細(xì)胞的DC-CIK組，可見部分腫瘤細(xì)胞壞死。

綜上所述，DC-CIK細(xì)胞是一種新型、高效的免疫活性細(xì)胞，可以有效地抑制體內(nèi)腫瘤的生長。Tregs具有很強(qiáng)的免疫抑制作用，能夠抑制DC-CIK細(xì)胞的抗腫瘤活性，清除Tregs可以增強(qiáng)DC-CIK細(xì)胞的抗腫瘤作用，這為有效進(jìn)行腫瘤免疫治療提供了一種切實(shí)可行的方法。

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