慢性肢體淋巴水腫動(dòng)物模型的構(gòu)建

侯傳強(qiáng) 金 星 吳學(xué)君 李寶江

(1. 泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院乳腺外科，山東 泰安 271000；2. 山東省立醫(yī)院血管外科，山東 濟(jì)南 250021)

肢體淋巴水腫模型的構(gòu)建對(duì)于研究淋巴水腫發(fā)病機(jī)制、探討有效治療方法至關(guān)重要。長(zhǎng)期以來(lái)多種造模方法，多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如狗、兔、大白鼠等都曾被用來(lái)造模。本實(shí)驗(yàn)采用先施行環(huán)切手術(shù)后短期內(nèi)放療的方法制作兔后肢淋巴水腫模型。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大白兔20只，山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)兔場(chǎng)提供，體重在2.5 kg左右(2.0～3.0 kg)，雌雄不限。右后肢作為實(shí)驗(yàn)肢體，左后肢作為對(duì)照。

1.2手術(shù)方法

用2.5%的戊巴比妥鈉麻醉，大約劑量為1 ml/kg體重，根據(jù)角膜反射和兔肢體對(duì)外力過(guò)伸運(yùn)動(dòng)反應(yīng)及呼吸深淺及幅度調(diào)整麻醉劑量。麻醉成功后，剪去下肢手術(shù)區(qū)(腹股溝遠(yuǎn)端約6 cm區(qū)域)長(zhǎng)毛，用脫毛劑進(jìn)一步脫去毛發(fā)。同法處理右下肢足背趾蹼處皮膚，消毒后皮內(nèi)注射10%亞甲藍(lán)注射液0.5 ml。手術(shù)區(qū)消毒、鋪無(wú)菌洞巾，在腹股溝遠(yuǎn)端約1 cm處取環(huán)形切口，游離、切除以遠(yuǎn)3 cm寬皮膚、皮下組織達(dá)肌肉，用手術(shù)刀搔刮創(chuàng)面徹底清除模型組織，清掃腹股溝區(qū)淋巴結(jié)，手術(shù)顯微鏡下分離與股部血管、神經(jīng)伴行的深部淋巴管(已被亞甲藍(lán)藍(lán)染，見(jiàn)圖1)，兩端結(jié)扎，中間切除約4 cm。股部血管以附近肌肉覆蓋，皮膚上、下端切緣內(nèi)翻(至關(guān)重要)縫在肌肉上，外涂紅霉素軟膏，無(wú)菌包扎。術(shù)后每只兔子給予青霉素80萬(wàn)單位，靜脈推注，連續(xù)3天。定期給予創(chuàng)面換藥，使其瘢痕愈合。

圖1 藍(lán)染的股靜脈周?chē)馨凸?圖2 慢性淋巴水腫模型

1.3放射方法

3天后重新麻醉動(dòng)物，固定于木質(zhì)固定架上，右下肢略外展伸直，使用60Co照射儀，照射野為4 cm×3 cm，一次性給予2000 cGry劑量照射手術(shù)野。

1.4觀察指標(biāo)：

1.4.1肢體水腫體積 每周采用排水法(膝上1 cm)測(cè)量雙下肢體積變化，計(jì)算出實(shí)驗(yàn)側(cè)肢體與對(duì)照側(cè)肢體體積的差值，即肢體水腫體積，各組時(shí)間點(diǎn)均從未處理前算起。

1.4.2水腫組織、瘢痕區(qū)和正常組織微淋巴管計(jì)數(shù) 6個(gè)月時(shí)取水腫組織、瘢痕區(qū)和對(duì)照側(cè)肢體正常組織免疫組化法檢測(cè)Flt-4，在高倍顯微鏡下計(jì)數(shù)染色的微淋巴管數(shù)目。每張染色玻片中選5個(gè)高倍鏡視野，總數(shù)作為淋巴管計(jì)數(shù)。

1.4.3超聲檢查 急性水腫期及6個(gè)月慢性水腫模型形成后均用彩色多普勒檢查右下肢，明確下肢動(dòng)、靜脈情況，除外深靜脈血栓形成引起的肢體腫脹。

2 結(jié) 果

2.120只動(dòng)物有1只因麻醉死亡，有1只動(dòng)物因感染死亡，其余18只動(dòng)物均在3天后開(kāi)始出現(xiàn)肢體淋巴水腫，半月后達(dá)到高峰，5～6周時(shí)開(kāi)始消退。3個(gè)月后，多數(shù)動(dòng)物開(kāi)始出現(xiàn)漸進(jìn)性的肢體水腫，5個(gè)月后達(dá)高峰，此時(shí)形成穩(wěn)定的淋巴水腫的兔為慢性淋巴水腫模型，共15只，除掉死亡動(dòng)物，造模成功率為83%(15/18)。平均肢體水腫體積變化見(jiàn)圖表1。

2.2水腫組織、瘢痕區(qū)和正常組織微淋巴管計(jì)數(shù) (見(jiàn)表1)。

表1 各組微淋巴管計(jì)數(shù)

組別(n)微淋巴管計(jì)數(shù)( x±s)水腫組織(n=15)92.25±10.12瘢痕組織(n=15)39.99±5.7正常組織(n=15)66.97±7.13F=165.48P=0.0000

2.3超聲檢查 急性水腫期及慢性水腫模型形成后彩色多普勒檢查未發(fā)現(xiàn)深靜脈血栓形成，提示肢體腫脹不是因血管原因引起。

3 討 論

肢體淋巴水腫模型的研究經(jīng)歷了百余年的漫長(zhǎng)歷史。1934年Drinker[1]等采用反復(fù)手術(shù)破壞狗的腹股溝淋巴管，并在淋巴管內(nèi)注射硬化劑制造了慢性淋巴水腫模型。1967年Olszewiski[2]等采用環(huán)形切除皮膚、皮下軟組織，切除淋巴管，方法制造狗后肢淋巴水腫模型，但是成功率較低。 1981年Suman[3]等報(bào)告了使用放射與手術(shù)相結(jié)合的方法制備狗肢體淋巴水腫模型，淋巴水腫發(fā)生率達(dá)100%。 1990年Mitchel[4]等利用手術(shù)與放療相結(jié)合的方法制備了大鼠肢體淋巴水腫模型， 1999年Lee-Donaldson[5]等采用同法制備了大鼠肢體淋巴水腫模型，結(jié)果表明手術(shù)與放療相結(jié)合造模可以產(chǎn)生中、重度淋巴水腫，且穩(wěn)定而持久。孫灃等[6]應(yīng)用傳統(tǒng)的淋巴結(jié)根治與 60鈷照射相結(jié)合的方法成功制作了兔后肢淋巴水腫模型，成活動(dòng)物中淋巴水腫模型成功率達(dá)到100%。梁炳生等[7]比較了手術(shù)、放療、先放療后手術(shù)、先手術(shù)后放療4種制作方法，發(fā)現(xiàn)手術(shù)與放療相結(jié)合是一種造模的最好方法。

本實(shí)驗(yàn)的研究表明手術(shù)與放療相結(jié)合造模成功率較高(83%)；而且術(shù)后加上放射更接近于乳癌術(shù)后、盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)后放射治療后淋巴水腫的形成，作為此類(lèi)疾病研究的動(dòng)物模型，更具有說(shuō)服力；一次性放射治療減少了反復(fù)射線照射環(huán)節(jié)，簡(jiǎn)單方便，是一種較好的造模方式。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肢體淋巴水腫體積的變化，了解到淋巴水腫形成的規(guī)律，模型制作術(shù)后3天開(kāi)始出現(xiàn)肢體淋巴水腫，多數(shù)1月左右達(dá)到高峰，6周時(shí)開(kāi)始消退。4個(gè)月后開(kāi)始出現(xiàn)漸進(jìn)性的肢體水腫，5個(gè)月后達(dá)高峰，此時(shí)出現(xiàn)穩(wěn)定淋巴水腫的兔為慢性淋巴水腫模型。我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，模型制作成功與否與操作的精細(xì)程度密切相關(guān)：其一環(huán)形切除皮膚后要徹底搔刮掉皮下肌間隙膜性組織；其二要徹底切斷結(jié)扎股深部淋巴管，根據(jù)藍(lán)染標(biāo)記可見(jiàn)淋巴管環(huán)繞股靜脈有多條分支并有多個(gè)交通支存在，術(shù)中均應(yīng)徹底切除并結(jié)扎遠(yuǎn)近斷端；其三縫合皮膚與肌肉務(wù)必內(nèi)翻縫合，否則兩端皮膚很快蔓延覆蓋創(chuàng)面，形不成瘢痕愈合。另外，微淋巴管計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，瘢痕組織中微淋巴管明顯減少，表明手術(shù)及放射很大程度上破壞了淋巴系統(tǒng)，導(dǎo)致遠(yuǎn)端阻塞性水腫；而水腫組織中微淋巴管則明顯反應(yīng)性增生，表明了一個(gè)機(jī)體自身代償?shù)倪^(guò)程，但此時(shí)的淋巴管系統(tǒng)是雜亂無(wú)章的，未形成有效的引流管道，但是由于管道總體橫徑增大，致使?jié)B出增多，這在一定程度上更加重了淋巴水腫。

[1] Drinker CK ,Field ME ,et al. The experimental production of edema and elephantiasis as a result of lymphatic obstruction[J]. Amj Physiol, 1934, 108: 509.

[2] Olszewiski W，et al. Experimental lymphedema in dogs[J]. J Cardiovasc Surg (Torino), 1968, 9: 178.

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[5] Lee-donaldson L, Witte MH, Bernas M, et al. Refinement of a rodent model of peripheral lymphedema[J]. Lymphology, 1999,32:1 11-117.

[6] 孫灃，曹衛(wèi)剛、李圣利，等.實(shí)驗(yàn)性兔后肢淋巴水腫模型構(gòu)建[J].上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，24(6)：426-431.

[7] 梁炳生,馮 勇,常文凱，等.慢性肢體淋巴水腫模型的比較研究[J].實(shí)用骨科雜志，2004, 10(3)：216-218.