子宮內(nèi)膜異位癥中HO-1的表達(dá)與內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的相關(guān)性研究

譚風(fēng)和 李 萍

(1. 濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 牟平 264100；2. 泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 泰安 271000；)

逆流種植、體腔上皮化生和誘導(dǎo)學(xué)說是EMT[1]的主要病因。郎景和提出了“在位內(nèi)膜決定論”，認(rèn)為子宮內(nèi)膜在宮腔外需要經(jīng)過粘附、侵襲、血管形成才得以種植、生長、發(fā)生病變，起決定作用的可能是在位內(nèi)膜的特性[2]。研究表明，異位內(nèi)膜完成上述過程中，起重要作用的可能是子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡、機(jī)體全身及局部免疫狀態(tài)和功能、激素、細(xì)胞因子等。本研究采用免疫組化技術(shù)檢測HO-1、Bcl-2和FasL在正常子宮內(nèi)膜、EMT在位、異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)，初步探討EMT發(fā)病與HO-1、Bcl-2和FasL的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1資料 2006年5月至2009年12月泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床病理資料完整的子宮內(nèi)膜異位癥患者的石蠟包埋標(biāo)本41例，其中增生期21例，分泌期20例。選取以上行卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫手術(shù)患者34例，其中增生期18例，分泌期16例，獲取在位內(nèi)膜；選取診斷性刮宮或手術(shù)切除子宮并經(jīng)病理證實(shí)為正常子宮內(nèi)膜標(biāo)本32例，其中增生期16例，分泌期16例。選取對象年齡31～51歲。

所有參與者3個(gè)月內(nèi)未應(yīng)用激素治療,無其它內(nèi)外科及內(nèi)分泌疾病,月經(jīng)周期規(guī)律,根據(jù)病理結(jié)果劃分增生期和分泌期。所有組織取材后經(jīng)10%甲醛固定,石蠟包埋, 5μm連續(xù)切片5張, 其中1張行常規(guī)HE染色后進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,剩余者行免疫組化染色。

1.2方法 采用免疫組化SABC法檢測3項(xiàng)指標(biāo)的蛋白表達(dá)，HO-1、Bcl-2、FasL抗體，SABC免疫組化試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。操作按試劑盒說明。

1.3結(jié)果 判定HO-1的陽性部位主要定位于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞胞漿中，少量定位于子宮內(nèi)膜胞膜和胞核。FasL的陽性部位主要定位于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞胞漿中。Bcl-2的陽性部位主要定位于子宮內(nèi)膜細(xì)胞膜和胞漿中。應(yīng)用計(jì)算機(jī)彩色圖文病理分析系統(tǒng)觀察每張切片的蛋白表達(dá)情況。免疫組化染色后選取染色清晰、定位明確、結(jié)構(gòu)完整的棕黃色細(xì)胞作為陽性表達(dá)。高倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例和陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行定量測定[18]。陽性細(xì)胞所占比例評分為：陽性細(xì)胞數(shù)<10%為0分；11%～40%為1分；41%～70%為2分；>70%為3分；染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn):不著色0分；黃色1分；棕黃色2分；黃褐色3分。二者評分相加，0-1分為陰性；2分以上為陽性。

1.4采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用四格表χ2檢驗(yàn)及Fisher精確概率法。取檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1HO-1在各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)膜組織中的表達(dá)

HO-1增生期和分泌期異位內(nèi)膜組表達(dá)強(qiáng)于在位內(nèi)膜組及對照組(P<0.05)；對照組及在位內(nèi)膜組HO-1表達(dá)隨月經(jīng)周期而發(fā)生變化, 分泌期顯著強(qiáng)于增生期，異位內(nèi)膜組HO-1表達(dá)失去周期性變化。

表1 HO-1在各實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)

*：與同分期在位內(nèi)膜組比較P=0.001；△：與同分期正常對照組比較P=0.001

2.2Bcl-2在各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)膜組織中的表達(dá)

Bcl-2增生期和分泌期異位內(nèi)膜組表達(dá)均強(qiáng)于在位內(nèi)膜組及對照組(P<0.05)；對照組及在位內(nèi)膜組Bcl-2表達(dá)隨月經(jīng)周期而發(fā)生變化，增生期顯著強(qiáng)于分泌期，異位內(nèi)膜組Bcl-2表達(dá)失去周期性變化。

表2 Bcl-2在各實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)

*：與同分期在位內(nèi)膜組比較P=0.02；△：與同分期正常對照組比較P=0.02；#：應(yīng)用Fisher精確法計(jì)算概率。

2.3FasL在各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)膜組織中的表達(dá)

FasL在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中的表達(dá)均高于同期正常子宮內(nèi)膜的表達(dá)，F(xiàn)asL在正常子宮內(nèi)膜的表達(dá)具有周期性，增生期明顯低于分泌期(P<0.05)；在在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中的表達(dá)則失去周期性變化。

表3 FasL在各實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)

*：與同分期在位內(nèi)膜組比較P=0.005；△：與同分期正常對照組比較P=0.001；#：應(yīng)用Fisher精確法計(jì)算概率

3 討 論

3.1HO-1在EMT中的表達(dá)及意義

HO-1是一種在機(jī)體內(nèi)廣泛存在的抗氧化防御酶，其主要作用方式為通過其酶解產(chǎn)物在體內(nèi)發(fā)揮抗炎、抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡等作用。HO-1能降解血紅素產(chǎn)生CO、膽綠素和鐵離子等產(chǎn)物。目前，HO-1與EMT發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性研究較少。有研究發(fā)現(xiàn), HO-1可以引起鐵、膽綠素和CO的局部產(chǎn)物的過度表達(dá)，在異位子宮內(nèi)膜損傷性出血的部位，高鐵和膽紅素沉著物的存在是受抑制的，另外，CO作為血管舒張因子，對損傷性新生血管的行成起一定的作用。多數(shù)研究認(rèn)為HO酶解反應(yīng)對細(xì)胞起保護(hù)作用，是機(jī)體對抗氧化應(yīng)激的一種代償性機(jī)制。有研究表明[3]，HO-1的表達(dá)在有誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的情況下，HO-1缺陷動(dòng)物對氧化應(yīng)激的易損傷性比對照組高。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HO-1缺陷的成年鼠會(huì)有缺鐵性貧血及肝、腎鐵的聚積，這會(huì)導(dǎo)致組織的氧化損傷，而且這些動(dòng)物在進(jìn)行器官移植后，出現(xiàn)排異反應(yīng)的概率也會(huì)增加，也更容易出現(xiàn)異常的炎癥性反應(yīng)。

本研究表明：HO-1在正常子宮內(nèi)膜增生期不表達(dá)或呈弱表達(dá), 在分泌期表達(dá)陽性率增加(P<0.01), 提示HO-1的表達(dá)與月經(jīng)周期明顯相關(guān)；在位內(nèi)膜的表達(dá)高于同期正常子宮內(nèi)膜(P<0.05)；異位內(nèi)膜組織中, HO-1呈高表達(dá)且無周期性變化, 與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。這提示HO-1 在EMT中的過度表達(dá)可能促進(jìn)了異位內(nèi)膜組織在宮腔外的種植與生長，表明EMT患者體內(nèi)的HO系統(tǒng)不能完全降解血紅素， HO-1的過度表達(dá)可能參與了EMT的發(fā)病機(jī)制及疾病進(jìn)程。

3.2Bcl-2在EMT中的表達(dá)及意義

在正常子宮內(nèi)膜增生期中，Bcl-2蛋白強(qiáng)表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，抑制子宮內(nèi)膜的凋亡，從而使子宮內(nèi)膜在月經(jīng)期脫落后可以從基底層修復(fù)；在分泌期Bcl-2弱表達(dá)，能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，使內(nèi)膜的過度增殖受到抑制，防止發(fā)生內(nèi)膜增生性疾病。Ioffe等[4]發(fā)現(xiàn)正常子宮內(nèi)膜的凋亡現(xiàn)象與月經(jīng)周期存在著密切的關(guān)系。另有研究表明[5]，盆腔EMT患者分泌期子宮內(nèi)膜Bcl-2過度表達(dá)，使細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)，使逆流到盆腔的內(nèi)膜細(xì)胞依舊有較高活性，而使其在盆腔存活，使EMT的發(fā)病成為可能。EMT患者在位內(nèi)膜的細(xì)胞凋亡率低于正常婦女,其異位內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率比其在位內(nèi)膜更低，這可能是由于該病患者月經(jīng)子宮內(nèi)膜中凋亡細(xì)胞所占比例減少，而逆流入腹腔的內(nèi)膜細(xì)胞仍具有活性，增加了種植、存活的機(jī)會(huì)。子宮內(nèi)膜異位至腹腔后，由于其凋亡率下降更不易發(fā)生凋亡，從而促進(jìn)了EMT的發(fā)生與發(fā)展。

本研究結(jié)果表明：Bcl-2在正常子宮內(nèi)膜增生期的表達(dá)高于分泌期(P<0.05)；在在位內(nèi)膜增生期的表達(dá)亦高于分泌期(P<0.05)；異位內(nèi)膜Bcl-2的表達(dá)增生期與分泌期無顯著差異，呈高表達(dá)而且沒有周期性，均高于正常內(nèi)膜和在位內(nèi)膜(P<0.05)。這說明EMT患者,由于Bcl-2的強(qiáng)表達(dá)，造成其異位內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡能力下降，使細(xì)胞凋亡減少，破壞了子宮內(nèi)膜細(xì)胞增生和凋亡間的平衡關(guān)系，導(dǎo)致異位內(nèi)膜細(xì)胞在“異地”種植、生長，形成EMT。

3.3FasL在EMT中的表達(dá)及意義

Fas/FasL系統(tǒng)是將凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的主要系統(tǒng)之一。Garcia Valasco等[6]研究表明EMT患者的腹腔液在炎癥就是通過異位的內(nèi)膜細(xì)胞誘導(dǎo)FasL的表達(dá)，來殺傷由Fas介導(dǎo)的免疫活性細(xì)胞。這可能就是異位內(nèi)膜細(xì)胞未被免疫排斥，進(jìn)而在異位能夠種植和生長的原因。異位內(nèi)膜組織可能通過激活FasL基因的轉(zhuǎn)錄使FasL蛋白過表達(dá)，而通過低表達(dá)Fas蛋白抵抗由Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用，，從而使Fas陽性的免疫細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，使得異位組織被免疫監(jiān)督與清除的情況減弱，最終使得宮腔外的異位內(nèi)膜種植、存活，使EMT的發(fā)生成為可能。

本研究表明：FasL蛋白的表達(dá)主要分布于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的胞漿或胞膜；在正常對照組的子宮內(nèi)膜有少量表達(dá)，分泌期高于增生期 (P<0.05)；在位內(nèi)膜的分泌期表達(dá)低于正常對照組(P<0.05)；異位內(nèi)膜FasL蛋白的表達(dá)均高于正常對照組，且無周期性變化。這說明，增生期FasL 低表達(dá)，細(xì)胞凋亡減少，使子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞增生增加；進(jìn)入分泌期后，F(xiàn)asL表達(dá)增強(qiáng)，腺上皮細(xì)胞受凋亡基因的影響而發(fā)生凋亡； FasL在異位內(nèi)膜中的表達(dá)在增生期與分泌期無明顯差異，且同期表達(dá)顯著高于正常內(nèi)膜及在位內(nèi)膜。由此我們可以推測， FasL在異位內(nèi)膜組織中的高水平表達(dá)是可能與其逃避機(jī)體內(nèi)的免疫殺傷有關(guān)，使異位內(nèi)膜細(xì)胞避免免疫清除而繼續(xù)存活、生長，進(jìn)而使EMT的發(fā)生成為可能。另外，F(xiàn)asL在異位內(nèi)膜的無周期性表達(dá)也能夠使避免在月經(jīng)期的自殺性死亡。在育齡婦女中經(jīng)血逆流較常見而EMT的發(fā)生率卻不高，這可能與子宮內(nèi)膜的周期性改變受促凋亡基因的控制，在分泌期子宮內(nèi)膜凋亡程度增高，細(xì)胞活性降低有關(guān)。

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