5－FU誘導(dǎo)人肝細胞癌MDR的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究

韋 艷，張海英，梁 鋼*

(1.武警廣西總隊醫(yī)院，廣西南寧530003;2.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧530021)

5－FU誘導(dǎo)人肝細胞癌MDR的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究

韋 艷1，張海英2，梁 鋼2*

(1.武警廣西總隊醫(yī)院，廣西南寧530003;2.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧530021)

目的 尋找與人肝細胞癌多藥耐藥相關(guān)的蛋白質(zhì)分子，為進一步研究人肝細胞癌多藥耐藥機制提供依據(jù)。方法 體外培養(yǎng)人肝癌細胞Bel-7402及其耐5-氟尿嘧啶(5-FU)細胞Bel-FU，MTT法檢測Bel-FU的多藥耐藥性，雙向凝膠電泳技術(shù)分析細胞Bel-7402與Bel-FU之間的差異表達蛋白，經(jīng)MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定。Western blot驗證2-DE及質(zhì)譜的檢測結(jié)果。結(jié)果 與Bel-7402比較，Bel-FU中有24個蛋白表達上調(diào)，其中包括FAK、TM3、ORP150、CRT、hnRNP K、80K-H protein、EF-1-D、phosphoprotein 等，12 個蛋白表達下調(diào)。Western blot法檢測到蛋白FAK、CRT在Bel-FU中高表達，與2-DE結(jié)果一致。結(jié)論 通過建立人肝癌細胞Bel-7402及其耐5-氟尿嘧啶細胞Bel-FU的2-DE圖譜篩選了多藥耐藥相關(guān)的差異蛋白，為人肝細胞癌MDR的分子機制研究奠定了基礎(chǔ)。

肝細胞癌;多藥耐藥;比較蛋白質(zhì)組學(xué);雙向凝膠電泳

目前化學(xué)藥物治療作為肝癌臨床治療主要手段之一，面臨的最大難題就是多藥耐藥［1］(multidrug resistance，MDR)，這是指腫瘤細胞對某一種藥物產(chǎn)生耐藥性后，該腫瘤細胞逐漸對那些結(jié)構(gòu)無關(guān)、作用靶點不同，甚至是未接觸過的、機制不同的抗腫瘤藥物也具有交叉耐藥性。腫瘤MDR的發(fā)生機制非常復(fù)雜，通常認為是由一系列基因的失活與激活而導(dǎo)致的，然而從功能的角度上來看，無論是基因的突變還是轉(zhuǎn)錄及翻譯后的變化，其結(jié)果都導(dǎo)致基因表達產(chǎn)物的改變，從而改變了蛋白質(zhì)信號通路，因此有必要從蛋白質(zhì)整體水平來研究腫瘤細胞MDR。本研究基于比較腫瘤細胞、耐藥細胞之間蛋白質(zhì)的表達水平，以發(fā)現(xiàn)相關(guān)的特異性蛋白，為揭示腫瘤MDR發(fā)生的分子機制、防治以及靶點的發(fā)現(xiàn)提供科學(xué)依據(jù)，對新藥開發(fā)也更具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞:人肝癌細胞系Bel-7402(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

1.1.2 試劑:5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)、長春新堿(vincristin，VCR)和阿霉素(adriamycin，ADM)(浙江海正藥業(yè)公司)，柔紅霉素(Daunorubicin，DAN)和阿糖胞苷(cytarabine)(上海華聯(lián)制藥有限公司)，尿素、硫脲、CHAPS和DTT(Amresco公司)，IPG 緩沖液、IPG 膠條(pH4-7，24 cm，GE 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察細胞生長情況，0.25% 胰蛋白酶消化傳代，Bel-FU細胞培養(yǎng)時加入20 mg/L 5-氟尿嘧啶維持其多藥耐藥性，實驗前停1周，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 甲基四唑藍(MTT)法測定肝癌耐藥細胞Bel-FU多藥耐藥性:實驗分親本細胞和耐藥細胞兩組，每組設(shè)空白對照組(只加培養(yǎng)液)，陰性對照組(只加細胞)，抗癌藥物組。取單細胞懸液1×105個/mL種于同一 96孔板中，每孔100 μL置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。分別加入不同濃度的抗癌藥物5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、阿霉素、長春堿，以上藥品均以注射用0.9%氯化鈉注射液配成母液，使用時用培養(yǎng)液配成一系列的稀釋液，終體積至200 μL。培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，充分溶解藍紫色結(jié)晶，酶標儀選擇波長492 nm測吸光度值，實驗不同日重復(fù)3次取均數(shù)。計算細胞抑制率(inhibitive rate，IR)=(陰性對照組吸光度值－抗癌藥物吸光度值)/陰性對照組吸光度值×100%，LOGIT軟件計算求得IC50(50%inhibiting concentration，半抑制濃度)。耐藥指數(shù)(resistance index，RI)=耐藥細胞株IC50/親本細胞株IC50。

1.2.3 細胞總蛋白的提取:取對數(shù)生長期細胞，用PBS清洗3次，盡量讓培養(yǎng)瓶中不要殘留PBS。根據(jù)培養(yǎng)瓶底表面積的大小加入蛋白裂解液(瓶底面積每1 cm2加入10 μL蛋白裂解液)。讓裂解液充分與細胞接觸，靜置冰上裂解40 min，收集瓶中的裂解液，渦旋振蕩5 s×2次，4℃ 30 000 r/min離心50 min，取上清，蛋白質(zhì)定量試劑盒 2D Quantifi2cation kit定量。

1.2.4 雙向凝膠電泳(2-DE)及差異蛋白質(zhì)點的質(zhì)譜鑒定:取樣品蛋白加入IPG緩沖液2.5μL，再加入水化儲存液使總體積至450 μL。設(shè)置IPGphor儀器的運行參數(shù)。程序結(jié)束后取出膠條進行平衡，IPG膠條平衡2次。裝好灌模具，灌膠。將平衡好的膠條小心的放置于膠面上并輕壓使膠條與膠面充分接觸，并覆蓋2 mL瓊脂糖溶液后開始電泳。硝酸銀染色程序如下:固定30 min，敏化30 min，漂洗5 min×3次，銀染20 min，漂洗1 min×2次;顯色后加入適量冰醋酸終止。染色后的凝膠經(jīng)ImageScanner掃描儀掃描獲得蛋白質(zhì)點圖譜，所得圖譜用ImageMaster 2-DE Platinum 5.0軟件分析。圖像分析過程包括背景消減、獲取蛋白質(zhì)斑點位置坐標等的校正，然后分別將同種細胞3次電泳所得的蛋白質(zhì)點圖譜在軟件中創(chuàng)建平均膠，以其中一組的平均膠為參照膠與另一組的平均膠進行匹配，尋找兩種細胞間差異表達的蛋白質(zhì)點。蛋白點灰度值差異達到2.5倍以上認定為差異蛋白。將差異蛋白質(zhì)點切下，進行酶解，提取酶解的肽段后脫鹽，進行MALDI-TOF-MS檢測，通過rNCBI數(shù)據(jù)庫獲取蛋白質(zhì)點的信息。

1.2.5 Western blot法檢測FAK、CRT蛋白表達:消化收集細胞，加入適量細胞裂解液，冰上放置30 min，10 000×g離心40 min取上清，bradford 法測定提取蛋白的濃度。進行十二烷基磺酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度為7%，濃縮膠濃度為4%。采用濕法轉(zhuǎn)膜，200 mm/mol恒流，轉(zhuǎn)移時間2 h。5%BSA封閉4℃過夜，與一抗、二抗雜交反應(yīng)后，過氧化物酶HRP-ECL顯影，掃描后應(yīng)用quantity-one軟件分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

MTT法中數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，藥物對細胞的半數(shù)抑制濃度IC50值根據(jù)LOGIT計算軟件確定。組間均數(shù)的比較采用t檢驗，采用SPSS16.0軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 肝癌耐藥細胞多藥耐藥性

耐藥細胞Bel-FU對5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、長春新堿、阿霉素和柔紅霉素的耐藥指數(shù)分別為89.6、3.9、37.1、15.0 和3.7 倍(P＜0.05)(表1)。

表1 Bel-FU對各種抗癌藥物的耐藥指數(shù)Table 1 Resistance index of Bel-FU to different anticancer drugs(±s，n=3)

表1 Bel-FU對各種抗癌藥物的耐藥指數(shù)Table 1 Resistance index of Bel-FU to different anticancer drugs(±s，n=3)

*P ＜0.05 compared with Bel-7402．

drug IC50(μmol/L)RI Bel-7402 Bel-FU 5-FU 36.21±4.80 3243.52±67.52*89.6 cytarabine 3.72±0.54 14.51±2.19* 3.9 VCR 0.74±0.13 27.45±2.19* 37.1 ADM 2.20±1.03 33.08±6.16* 15.0 DAN 1.23±0.13 4.55±0.89*3.7

2.2 2-DE凝膠圖譜

圖1為細胞Bel-7402與Bel-FU總蛋白雙向電泳凝膠圖以及之間的36個差異蛋白點。與Bel-7402比較，24個蛋白點在Bel-FU上調(diào)，分別編號為1 至 17、23、31、32、33、34、35、36 和 12 個蛋白點在Bel-FU 下調(diào)，分別編號為 18、19、20、21、22、24、25、26、27、28、29和 30。圖2 為 Bel-7402 與 Bel-FU 之間部分差異蛋白點的放大圖。

2.3 差異表達蛋白質(zhì)的質(zhì)譜檢測選結(jié)果

選取在細胞Bel-FU中高表達的部分差異蛋白點進行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜鑒定(編號為2、3、5、8、9、10、12 和15 的8 個蛋白質(zhì)點)。通過搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫，獲取各蛋白質(zhì)點信息(表2)。

表2 各差異蛋白質(zhì)點信息Table 2 Information of the differential expression protein

2.4 Western blot檢測蛋白FAK、CRT的表達

敏感細胞Bel-7402與耐藥細胞Bel-FU中蛋白FAK、CRT表達變化情況(圖3)。各組細胞樣品蛋白中 FAK/β-actin、CRT/β-actin 比值(表3)。

圖3 FAK、CRT蛋白表達區(qū)帶Fig 3 The Western blot of FAK and CRT

表3 FAK、CRT蛋白表達變化Table 3 The differential expression of FAK and CRT(±s，n=3)

表3 FAK、CRT蛋白表達變化Table 3 The differential expression of FAK and CRT(±s，n=3)

*P＜0.05 compared with Bel-FU．

ratio Bel-7402 Bel-FU FAK/β-actin 0.550 ±0.031*0.969±0.064 1.030±0.071 CRT/β-actin 0.659 ±0.024*

3 討論

MTT實驗顯示5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的耐藥細胞對5-氟尿嘧啶具明顯抗藥性，對長春新堿、阿霉素有交叉抗藥性，對阿糖胞苷、柔紅霉素的抗藥性較小。通過對兩組雙細胞樣品雙向凝膠電泳蛋白質(zhì)圖譜進行分析比較，在pH 4～7范圍的凝膠圖譜里，Bel-7402組與Bel-FU組之間的差異蛋白中，經(jīng)MALDITOF MS鑒定了8個在Bel-FU細胞中高表達的蛋白，分別為:黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)、低氧上調(diào)蛋白 1(hypoxia up-regulated 1，HYOU1 protein)、葡萄糖苷酶Ⅱ(glucosidaseⅡ)、鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，CRT)、蛋白激酶C底物80K-H蛋白(80K-H protein)、原肌球調(diào)節(jié)蛋白(tropomodulin 3)、延伸因子1(elongation factor-1-delta)、異源核糖核蛋白K(heterogeneous nuclear ribonucleo protein K，hnRNP K)，經(jīng) Western blot驗證 FAK、CRT在耐藥細胞中呈現(xiàn)出高表達。這些表達量上調(diào)的蛋白分子功能主要與細胞結(jié)構(gòu)、細胞周期、增殖、凋亡、能量代謝及核酸合成與代謝相關(guān)。

耐藥細胞中FAK的高表達提示抑制化療藥物誘導(dǎo)的細胞凋亡［2－3］。細胞間黏附和群集是產(chǎn)生耐藥的原因之一，已有研究證實反義FAK寡核苷酸可有效地干預(yù)細胞黏附，促進腫瘤細胞凋亡，而這些都可能影響到化療藥物的敏感性［4］，以FAK為靶點的對抗細胞附性治療對腫瘤耐藥會有逆轉(zhuǎn)作用。在Bel-FU細胞中FAK上調(diào)倍數(shù)達到3倍以上，由此推測，F(xiàn)AK可能是5-FU誘導(dǎo)細胞耐藥的關(guān)鍵因子之一;HYOU1也稱為氧調(diào)節(jié)蛋白150(oxygen-regulated protein，ORP150)，其高表達提示耐藥可能是通過促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)從而對腫瘤細胞起到保護的作用來實現(xiàn)的。有研究發(fā)現(xiàn)［5］，人肝癌細胞中ORP150基因及蛋白表達均高于正常肝細胞中的表達量，經(jīng)反義RNA技術(shù)后肝細胞癌的凋亡明顯增加而侵襲性無改變，ORP150有望成為肝細胞癌MDR的治療靶點;葡萄糖苷酶Ⅱ作為胰島素作用通路上的調(diào)節(jié)酶，其活性升高不僅與糖尿病和胰島素抵抗有關(guān)，并且能與多種激素介導(dǎo)細胞代謝、增殖的信號通路調(diào)控，而這些信號通路的異常活躍與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展亦有密切關(guān)系，目前葡萄糖苷酶Ⅱ具體通過哪些細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了MDR還有待研究和探討。CRT是一種普遍存在且高度保守的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣結(jié)合蛋白，CRT通過調(diào)節(jié)腫瘤抗原的遞呈、抑制血管的生成而與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，有研究比較分析了肝癌患者、肝癌高危人群及正常人中蛋白質(zhì)的表達差異，結(jié)果前者血液中CRT及其裂解片段遠高于后兩者［6］。在本實驗中，耐藥細胞中CRT的高表達量對MDR機制研究中具有重要的意義;蛋白激酶C底物80K-H蛋白的上調(diào)，多見于多囊性肝病，而實驗中發(fā)現(xiàn)其在耐藥細胞中高表達很可能預(yù)示細胞中蛋白激酶C含量的增加耐導(dǎo)致耐藥;原肌球蛋白(tropomyosin，TM)是通過穩(wěn)定肌動蛋白的狀態(tài)參與肌肉收縮的重要蛋白，在誘導(dǎo)細胞間質(zhì)的轉(zhuǎn)移以及細胞調(diào)亡中起重要作用。已有研究報道原肌球蛋白在腫瘤轉(zhuǎn)移和耐藥細胞中呈現(xiàn)高表達，如:在人急性早幼粒細胞白血病維甲酸敏感細胞株和維甲酸耐藥細胞株的差異耐藥相關(guān)蛋白中，也發(fā)現(xiàn)原肌球蛋白在耐藥細胞中呈現(xiàn)高表達的情況，提示了原肌球蛋白參與了腫瘤耐藥過程［7］。在肝癌轉(zhuǎn)移亞細胞中原肌球蛋白表達上調(diào)［8］，提示該蛋白在參與腫瘤轉(zhuǎn)移過程所起的重要作用，因此是否可以把原肌球蛋白作為篩選抗腫瘤藥和逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR劑的靶點將有待后期的繼續(xù)研究。hnRNP K屬于RNA結(jié)合蛋白亞家族的一種多功能蛋白分子，目前已有研究證實hnRNP K與乳腺癌、淋巴瘤等腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［9－10］。并且發(fā)現(xiàn)DNA損傷后可引起hnRNPK作為轉(zhuǎn)錄激活因子，通過增強P53、C-MYC、EGR和BRCA1基因的表達［11］因此 hnRNPK可能通過激活腫瘤MDR相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生耐藥。由此可見，由5-FU誘導(dǎo)的肝癌細胞MDR是通過多途徑多通道的機制實現(xiàn)的，篩選出的這些差異蛋白質(zhì)為今后的MDR深入研究提供了重要的依據(jù)。

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Comparative proteomics analysis of human hepatocellular carcinoma MDR induced by 5-FU

WEI Yan1，ZHANG Hai-ying2，LIANG Gang2*

(1.Guangxi Provincial Crops Hospital of Chinese People's Armed Police Force，Nanning 530003;2.Pharmacy College，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China)

ObjectiveTo search the protein from human hepatocellular carcinoma MDR and provide evidence for the mechanism of hepatocellular carcinoma MDR．MethodsHuman hepatocellular carcinoma cell line Bel-7402 and 5-FU resistant cell line Bel-FU were cultured．The MDR of Bel-FU was detected by MTT assay，to screen the differential expression protein between Bel-7402 and Bel-FU by 2-DE and MALDI-TOF/TOF．ResultsCompared with those in Bel-7402，24 proteins were up-regulated in Bel-FU including FAK，TM3，ORP150，CRT，hnRNP K，80K-H protein，EF-1-D，phosphoprotein and so on，and 12 proteins were down-regulated．Western blot confirmed that FAK and CRT were up-regulated in Bel-FU，the results were in accordance with the results of 2-DE．ConclusionsThe differential expression protein between Bel-7402 and Bel-FU may support the study of molecule mechanism of MDR．

hepatocellular carcinoma;multidrug resistance;comparative proteomics;2-DE

R 966

A

1001-6325(2012)09-1015-06

2011－10－20

2011－12－28

國家自然科學(xué)基金(30760310);廣西地方性高發(fā)疾病防治研究重點實驗室基金(桂科能0842009-k6);廣西科學(xué)基金(桂科自0728113);廣西中醫(yī)藥研究院中藥質(zhì)量標準研究重點實驗室開放課題基金(桂中重開0801)

*通信作者(corresponding author):Lianggang22@yahoo．com．cn