擬南芥MPK17基因在玉米中的電子克隆分析

王 琦 ，王俊紅 ，王 榮

(1.長治學院 生物科學與技術系，山西 長治 046011；2.陜西師范大學 生命科學學院，陜西 西安 710062；3.長治衛(wèi)生學校，山西 長治 046000)

擬南芥MPK17基因在玉米中的電子克隆分析

王 琦1，王俊紅2，王 榮3

(1.長治學院 生物科學與技術系，山西 長治 046011；2.陜西師范大學 生命科學學院，陜西 西安 710062；3.長治衛(wèi)生學校，山西 長治 046000)

文章主要運用生物信息學的方法，利用擬南芥MPK17基因在玉米中進行了電子克隆，并得到了目的基因，進一步對其DNA堿基序列與蛋白質氨基酸序列進行了分析，旨在為更好地研究MPK17基因提供一定的理論資料。

擬南芥；玉米；MPK17；電子克隆

擬南芥(Arabidopsis thaliana)形態(tài)結構簡單，莖直立，花小，株高15-30cm，生殖周期短，繁殖系數(shù)高[1-3]。其基因組全序列測序工作已于2000年12月完成[4]，這樣使得有關擬南芥基因克隆、結構與功能的研究發(fā)展迅速。且在已知基因組的高等植物中，擬南芥核基因組最小[5]。基因組中所含高度重復，中度重復及低度重復的比例也很低，絕大多數(shù)為單拷貝序列[6-8]。

MAP激酶(Mitogen activated protein kinases MPKs)，中文全稱為有絲分裂原活化蛋白激酶[9]，它與其他一系列蛋白激酶構成級聯(lián)放大信號通路[10]，控制細胞生物學反應和參與植物對多種外界刺激的信號轉導過程[11]。對MPK最早研究始于哺乳動物和酵母(Yeast)，近年來，在擬南芥、苜蓿(Medicago sativa Linn)、煙草(Nicotiana tabacum)、水稻(O-ryza sativa)等高等植物中也取得了很大的進展[12-14]。文章主要通過生物信息學方法，分析了單子葉植物玉米(Zea mays)中存在的MPK17基因，旨在增強人類對于MPK17基因的認識，提高人類對玉米生長發(fā)育的控制能力，增加玉米抗旱、抗脅迫的能力，從而最終達到增加產量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥MPK17基因編碼的氨基酸序列、克隆得到的玉米新蛋白激酶的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列等。

1.2 方法

1.2.1 玉米中MPK17基因的電子克隆分析

從GenBank的核酸數(shù)據(jù)庫中檢索擬南芥MPK17基因，獲得MPK17基因cDNA序列，以該序列為模板對玉米EST數(shù)據(jù)庫進行BLAST檢索，獲得與之部分同源的EST群，從中選取一條EST作為種子序列BLAST檢索玉米的EST數(shù)據(jù)庫，將檢出與種子序列同源性較高或有部分重疊的EST序列拼接組裝為重疊群，再以此重疊群序列重復以上BLAST檢索過程，反復進行EST重疊群序列的拼接和比對，直至檢出所有的重疊EST或重疊群不能繼續(xù)延伸，最終獲得玉米MPK17基因的cDNA全序列。

1.2.2 玉米MPK17基因及其編碼蛋白的生物信息學分析

(1)ORF分析

將之前電子克隆得到的玉米MPK17基因的cDNA在ORFFinder中進行開放讀碼框(ORF)分析。

(2)玉米MPK17基因編碼蛋白的一級結構分析

首先利用在線分析工具ExPASy tool對玉米MPK17基因編碼蛋白進行分子量分析，然后利用BIOEDIT軟件對玉米MPK17基因編碼蛋白的氨基酸序列分布進行分析。

(3)玉米MPK17基因編碼蛋白的二級結構分析

利用蛋白質二級結構在線預測工具ExPASy Secondery Structure Prediction GOR對玉米MPK17基因編碼蛋白進行二級結構分析。

(4)玉米MPK17基因編碼蛋白的三級結構分析

利用網絡同源建模服務器SWISS-MODEL對玉米MPK17基因編碼蛋白進行三級結構預測[15-17]。

(5)蛋白質等電點分析

利用生物軟件ANTHEPROT對玉米MPK17基因編碼蛋白進行等電點分析。

(6)蛋白質信號肽分析

利用在線生物軟件ExPASy Signal P對玉米MPK17基因編碼蛋白進行信號肽分析。

(7)蛋白質疏水性與跨膜區(qū)分析

利用生物軟件TopPred和TMHMM Server v.2.0分別對玉米MPK17基因編碼蛋白的疏水性與跨膜區(qū)進行分析。

(8)蛋白質電荷分布分析

利用在線生物軟件SAPS對玉米MPK17基因編碼蛋白進行電荷分布分析。

(9)蛋白質保守域分析

利用在線蛋白質保守域分析工具NCBICDSearch對玉米MPK17基因編碼蛋白進行結構域分析。

2 結果與分析

2.1 玉米MPK17基因的電子克隆

按照上述方法，使用擬南芥MPK17基因所編碼的氨基酸序列(NCBI登錄號：Q84M93.1)在玉米EST數(shù)據(jù)庫中利用tBLASTn程序進行同源檢索，最后將所有檢索到的EST進行拼接獲得一個長度為2344bp序列。然后把此序列在玉米EST數(shù)據(jù)庫里進行BLASTn檢索，結果表明，該序列受玉米EST數(shù)據(jù)庫完全支持(如圖1)。

圖1 玉米MPK17基因編碼蛋白序列檢索玉米EST數(shù)據(jù)庫Fig.1 EST database results of protein coded by corn MPK17 gene

2.2 玉米MPK17基因的ORF分析

開放閱讀框(ORF)的識別是證明一個新的DNA序列為特定的蛋白質編碼基因的部分或全部的先決條件。ORF是基因序列的一部分，包含一段可以編碼蛋白的堿基序列，不能被終止子打斷。由于蛋白質由三聯(lián)體密碼子所編碼，所以一個雙鏈DNA序列就有6個潛在的閱讀框。其中一條鏈的3個讀框稱為正向讀框，互補鏈上的三個讀框稱為反向讀框。本文將電子克隆得到的玉米MPK17基因的cDNA在ORF Finder中進行ORF分析，結果如圖2所示，不難發(fā)現(xiàn)在259-1998 bp之間有一個最長的完整ORF，長為1740 bp，編碼579個氨基酸。

圖2 玉米MPK17基因的ORFFinder結果Fig.2 ORFF inderr esult of corn MPK17 gene

2.3 玉米MPK17基因編碼蛋白一級結構分析

利用在線生物軟件ExPASy預測玉米MPK17基因編碼蛋白的分子量約為66.04 kDa。利用BIOEDIT軟件預測其氨基酸序列組成情況如圖3所示。

圖3 玉米MPK17基因編碼蛋白的氨基酸組成Fig.3 The amino acid composition of protein coded by corn MPK17 gene

2.4 玉米MPK17基因編碼蛋白二級結構分析

運用蛋白質二級結構在線分析工具GOR4對玉米MPK17基因編碼蛋白進行分析，結果如圖4所示，其中h代表α螺旋，e代表β折疊，c代表無規(guī)則卷曲。且α螺旋占35.06％；β折疊占15.20％；無規(guī)則卷曲占49.74％。由此可知，該玉米MPK17基因編碼蛋白是由大量α螺旋、無規(guī)則卷曲以及少量的β折疊所構成的。

圖4 GOR4分析玉米MPK17基因編碼蛋白的二級結構Fig.4 Secondary structures predicted by GOR4 of coded protein by corn MPK17 gene

2.5 玉米MPK17基因編碼蛋白三級結構分析

利用基于同源建模的分析工具Swiss-Model對玉米MPK17基因編碼蛋白進行三級結構分析，軟件自動選擇PDB數(shù)據(jù)庫中匹配度最高的的3py3A(磷酸化的p38-alpha MAPK激酶的晶體結構)作為模板，對目的蛋白進行三級結構的預測。由圖5可知，目的蛋白的確是由大量α螺旋、無規(guī)卷曲以及少量的β折疊共同構成的復雜結構，與上述二級結構的分析結果一致。

圖5 蛋白質的三級結構Fig.5 Tertiary structure of protein

2.6 蛋白質等電點分析

利用生物軟件ANTHEPROT對玉米MPK17基因編碼蛋白進行分析，結果如圖6所示，玉米MPK17基因編碼蛋白的理論等電點為6.43。

2.7 蛋白質信號肽分析

對蛋白質進行信號肽分析，有助于蛋白質功能域的區(qū)分及蛋白質細胞定位。用Signal P對玉米MPK17基因編碼蛋白進行信號肽分析，結果如圖7所示，通過直觀分析氨基酸分值，可知該玉米MPK17基因編碼蛋白的分值曲線不典型，因而得知玉米MPK17基因編碼蛋白沒有信號肽，屬于非分泌性蛋白。

圖6 等電點分析Fig.6 The anal ysis of isoel ectric point

圖7 玉米MPK17基因編碼蛋白信號肽分析Fig.7 Singal peptide prediction in protein coded by corn MPK17 gene

2.8 蛋白質疏水性和跨膜區(qū)分析

利用TopPred軟件對玉米MPK17基因編碼蛋白進行分析，結果如圖8所示，橫坐標表示蛋白質中氨基酸殘基的序號，縱坐標表示殘基的親水/疏水特性，正值為疏水，負值為親水。因此，可以判斷得出，該蛋白質為親水性蛋白。

利用TMHMM Server v.2.0對玉米MPK17基因編碼蛋白跨膜區(qū)進行分析，結果如圖9所示，其中橫坐標代表蛋白質中氨基酸殘基的序號，縱坐標代表可能性的大小，結果表明此蛋白質不存在跨膜區(qū)，說明不是跨膜蛋白。

圖8 玉米MPK17基因編碼蛋白親/疏水性分析Fig.8 Hydrophilic/hydrophobic analysis of protein coded by corn MPK17 gene

圖9 玉米MPK17基因編碼蛋白跨膜區(qū)Fig.9 Striding filmsection of protein coded by corn MPK17 gene

2.9 蛋白質電荷分布分析

利用在線分析工具SAPS對玉米MPK17基因編碼蛋白氨基酸序列進行蛋白質電荷分布分析，結果如圖10所示，該蛋白質含有88個帶負電荷的氨基酸(Glu和Asp)和82個帶正電荷的氨基酸(Arg和Lys)，因此該玉米MPK17基因編碼蛋白總計帶6個負電荷。

2.10 蛋白質保守域分析

運用保守域(CD)分析玉米MPK17基因編碼蛋白的結構域，結果表明，玉米MPK17基因編碼蛋白中的保守結構域包括ATP結合位點，底物結合位點，活性位點以及KIM(即激酶相互作用模體)停泊位點，它們所在的具體位置則如圖11所示。

3 討論

電子克隆技術是伴隨著基因定位、人類基因組測序及生物信息學技術的發(fā)展而出現(xiàn)的，它是一種克隆基因的新方法。文章利用電子克隆技術從玉米中成功得到MPK17基因，并對該基因及其編碼蛋白進行了一系列生物信息學分析。經過初步分析，表明該目的基因長為2344 bp，編碼579個氨基酸。所編碼的蛋白質的分子量約為66.04 KDa，等電點為6.43，不存在跨膜區(qū)。該蛋白凈帶有六個負電荷，保守結構包括一些例如：ATP結合位點，底物結合位點，活性位點以及KIM停泊位點等。二級結構中，β折疊占15.20％；無規(guī)則卷曲占49.74％；α螺旋占35.06％。最后通過利用軟件SWISS-MODEL對其進行三級結構的預測，找到與其匹配度最高的模板3py3A，從而預測出它的三級結構。需要注意的是，在實驗過程中，筆者會采用不同的軟件對目的蛋白進行分析，難免有時的結果不一定全部一致。這是因為不同的數(shù)據(jù)庫，存放的數(shù)據(jù)有些差異，算法也有些差異，是屬于正常的，基本上大部分都是可靠的。總之，以上種種分析都僅僅只是一個推測，還需要在實驗室中進行進一步的研究論證。

圖10 玉米MPK17基因編碼蛋白電荷分布Fig.10 Change dist ribution of protein coded by corn MPK17 gene

圖11 玉米MPK17基因編碼蛋白質的保守域Fig.11 Conserved domain in protein coded by corn MPK17 gene

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In Silico Cloning Analysis of Arabidopsis Thaliana MPK17 in Zea Mays

Wang Qi1，Wang Jun-hong2，Wang Rong3
(1.Department of Life Science and Technology Changzhi University，Changzhi Shanxi 046011；2.College of Life Sciences Shaanxi Normal University，Xi'an Shaanxi 210037；3.Changzhi Municipal Health School，Changzhi Shanxi 046000)

MPK is a Ser/Thr-type protein kinase which exists widely in each eukaryote.Nowadays，a lot of MPKs have been isolated in the plant.However，in the plant the MPK research mainly concentrates on the double seed leaf pattern plant (e.g.Arabidopsis thaliana)，is very few about the single seed leaf pattern plant Zea mays'MPK research.We used Arabidopsis thaliana's MPK17 gene and then in silico cloned Zea mays'MPK17 gene using bioinformatics in the corn and moreover，carried on the preliminary analyses.It has provided the rich rationale for better research MPK17.

a rabidopsis thaliana；zea mays；mitogen activated protein kinase 17 (MPK17)；in silico cloning

Q785

A

1673-2014(2012)02-0009-05

2011—10—18

長治學院校級課題基金資助項目(2010111)。

王 琦(1980—)，男，山西長治人，碩士，講師，主要從事生物化學、分子生物學、生物信息學研究。

(責任編輯 王璟琳)