探討影響青霉素發酵產率的因素及過程控制

王慶起

探討影響青霉素發酵產率的因素及過程控制

王慶起

1 陳肖慶，黃樂毅.內酞胺類抗生素［M］.上海:科學文獻出版社，1987.

2 徐親民.抗生素工藝學［M］.北京:中國建材工業出版社，1994.

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本文以青霉菌為出發菌株，論述了青霉素的發酵生產的一般流程、影響發酵產率的因素及發酵過程控制。

1.青霉素的發酵生產

(1)菌種保存

青霉素生產菌種一般在真空冷凍干燥狀態下保存其分生孢子［1-2］。也可以用甘油或乳糖溶液做懸浮劑，在-70℃冰箱或液氮中保存孢子懸浮液或營養菌絲體。

(2)青霉素的發酵生產

種子制備階段包括孢子培養和種子培養兩個過程，孢子培養以產生豐富的孢子(斜面的孢子培養)為目的。而種子培養以繁殖大量健壯的菌絲體(種子罐的培養)為主要目的。

(3)青霉素的工藝要點

①生產孢子的制備將砂土孢子用甘油、葡萄糖和蛋白胨組成的培養基進行斜面培養后移到大米或小米固體培養基上，于25℃培養7天到孢子成熟后進行真空干燥，并以這種形式低溫保存備用。

②生產種子的制備 種子制備時以每噸培養基不少于200億孢子的接種量，接種到以葡萄糖、乳糖和玉米漿等為葡萄糖的一級種子罐內，于(27+-1)℃培養40h左右，控制通氣量為1:3m3/(m3 min)，攪拌轉速為300-350r/min。

③發酵生產發酵以葡萄糖、花生餅粉、麩質水、尿素、硝酸銨、硫代硫酸鈉、苯乙酰胺和碳酸鈣為培養基。發酵階段的工藝要求如表1所列對于分批發酵來說，這一過程又分為菌體生長和產物合成兩個階段。

(4)影響發酵產率的因素及過程控制①基質濃度的影響青霉菌能利用多種碳源如乳糖、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、淀粉和天然油脂等。乳糖是青霉素生長合成的最好碳源，葡萄糖次之，但必須控制其加入濃度，因為它的分解代謝物會抑制抗生素合成酶形成而影響青霉素的合成。可以采用連續添加葡萄糖的方法來代替乳糖。在分批發酵中，常常因為前期基質濃度過高對生物合成酶系產生阻遏或對菌絲生長產生抑制，而后期基質濃度低，限制了菌絲生長和產物合成。為了避免這一現象，在青霉素發酵中，通常采用分批補料操作法，即對容易產生阻遏、抑制和限制作用的基質進行緩慢流加，以維持一定的最適濃度。目前，糖濃度的檢測尚難在線進行，故葡萄糖的流加不是根據糖濃度控制，而是間接根據pH值、溶氧或二氧化碳釋放率予以調節。

②前體的影響及控制 苯乙酸或其衍生物苯乙酰胺等均可作為青霉素G的側鏈前體。青霉菌可將前體直接結合到產物分子中，也可作為養料和能源利用，即氧化為二氧化碳和水。前體究竟通過哪個途徑被菌利用，主要取決于培養條件以及所用菌種的特性，而現代工業生產所用的菌種，前體轉化率為46%-90%，為了避免前體加入濃度過大而對菌體產生不利影響，從基礎料中加入0.07%外，其余按需要同碳源一起補入。

前體對青霉菌的生長發育有毒性，其毒性大小取決于培養基的pH值和前體的濃度。苯乙酰胺在堿性時毒性較大，pH=8時即抑制菌體生長;苯乙酸在酸性時毒性較大，堿性時不抑制菌絲體生長;pH在中性時苯乙酰胺的毒性大于苯乙酸。前體用量大于0.1%時(除苯氧乙酸外)，青霉素的生物合成均會下降，尤以苯乙酰胺更甚。一般認為發酵液中，前體濃度始終維持在0.1%為宜。培養基成分對前體的氧化程度有較大影響。合成培養基比復合培養基對前體的氧化量少，這可以由前體氧化的中間產物-鄰羥基苯乙酸在培養基中的積累得到。

③pH值的影響及控制青霉素發酵的最適pH一般認為是6.5～6.9，應盡量避免超過7.0。因為青霉素在堿性條件下不穩定，容易加速水解。在青霉素發酵過程中，pH值是通過下列手段控制的:如pH值過高，可加糖、硫酸或無機氮源;pH值較低，可加入CaCO3、NaOH、氨或尿素，也可提高通氣量。

④溫度的影響及控制

青霉素發酵的最適溫度隨所用菌株的不同可能稍有差異，對菌絲生長和青霉素合成來說，最適溫度是不一樣的，一般生長的適宜溫度為27℃。而分泌青霉素的適宜溫度是在20℃左右。生產上采用變溫控制法使之適合不同發酵階段的需要。如采用從26℃逐漸降溫至22℃的發酵溫度，可延緩菌絲衰老，增加培養基中的溶氧度，延長發酵周期，有利于發酵后期的單位增長。

(5)溶氧的在線控制溶氧濃度是氧傳遞與氧消耗的動態平衡，而氧消耗與糖消耗成正比，當溶氧濃度將到30%飽和度以下時，青霉素產量急劇下降;低于10%飽和度時，則造成不可逆轉的損失。

(6)補料的影響在發酵過程中與料液一起補入表面活性劑，如新潔爾滅50×10-6或聚氧乙烯、山梨糖醇酐、三油酸酯等非離子表面活性劑，能增加青霉素的產量。.

表1 發酵階段的工藝要求

發酵時間的長短應從以下三個方面考慮:①累計產率最高;②單產成本最低;③發酵液質量最好。

操作變量 要求水平 操作變量 要求水平發酵罐容積 200m3 發酵液pH值180～220h 6.5～6.9裝料率 80% 初始菌絲濃度 1～2kg(干重)/m3輸入機械功率 2～4kW/m3 補料液中葡萄糖濃度 約500kg/m3空氣流量 48～72 m3/(m3h) 葡萄糖補加率 1.0～2.5kg(m3h)空氣壓力(表壓) 0.2MPa 發酵液中液氨濃度 0.25～0.3kg/m3發酵罐壓(表壓) 0.035～0.07MPa 發酵液中前體濃度 1kg/m3液相體積傳氧系數(K1a) 200/h-1 發酵液中溶氧濃度 ＞30%飽和度發酵液溫度 25℃ 發酵周期