耐高溫的結核分枝桿菌二株

吳龍章 蔡杏珊 譚耀駒 楊建良 劉燕文 鐘炳棠 陳劍鋒

耐高溫的結核分枝桿菌二株

吳龍章 蔡杏珊 譚耀駒 楊建良 劉燕文 鐘炳棠 陳劍鋒

分枝桿菌菌型鑒定在結核病流行病學調研和臨床用藥指導方面起到了至關重要的作用［1］，因由 Mtb或非結核分枝桿菌（non－tuberculosis Mycobacteria，NTM）引致的肺部疾病，其臨床癥狀和X線影像表現沒有任何的區別，但臨床治療有很大的差異甚至完全不同［2］，因此結核分枝桿菌復合群（MTC）與NTM正確的區分尤為重要。故中國防癆協會基礎專業委員會在1995年制定并于2006年再版修訂了《結核病診斷實驗室檢驗規程》（簡稱“規程”）［3］，其中分枝桿菌的鑒定程序為結核病流行病學調研和指導臨床用藥方面提供了可靠的業務保障。在規程中，對MTC的鑒定有明確的實驗室鑒定標準，如生長速度緩慢，不產色性，對硝基苯甲酸（PNB）、耐熱觸酶和吐溫－80水解試驗陰性，噻吩－2－羧酸肼（TCH）、硝酸鹽還原試驗及尿素酶分解試驗陽性，對5%NaCl不耐受等；培養溫度宜37℃，在28℃和42℃環境下不生長等。但筆者在對2913株分枝桿菌進行菌型鑒定時，在1736株確診為MTC株中發現2株（注：來自同一例患者）能在42℃高溫環境下生長的株種，現報道如下。

資料和方法

1.患者資料：男性，19歲。“反復咳嗽、咯痰3年”，因癥狀加重伴發熱、氣促3月余于2011年7月12日入院。入院體檢：體溫 （T）36.5 ℃，脈 搏 （P）113 次／min，呼吸 （R）24次／min；白細胞總數（WBC）18.9×109／L，中性粒細胞（N）0.8157；血紅蛋白（Hb）101.59g／L；肝腎功能無異常；尿常規示尿蛋白（＋）；X線結果顯示雙上、中、下肺野均可見結核病灶，并雙上、中肺野空洞形成；實驗室痰分枝桿菌涂片陽性（＋＋）。

2.儀器和試劑：培養所用的改良羅氏培養基和PNB、TCH、5%NaCl鑒別培養基，以及其他生化反應培養基均按照《規程》配制［3］。確證試驗MPB64單克隆抗體［4］購自杭州創新生物檢控技術有限公司，DNA微列陣技術序列分析［5］試劑購自北京博奧生物有限公司。

3.檢驗方法：分別于2011年7月13日和11月9日兩次留取晨痰，利用改良羅氏培養基做分枝桿菌培養，實驗序號：1111723和1119048。并分別于2011年8月25日和2011年12月30日培養陽性，菌落涂片經抗酸染色確認為分枝桿菌，后同時（2株菌株同時進行同一實驗，以下不再標示）按照《規程》進行藥物敏感度（藥敏）試驗和菌型鑒定［3］。以 MPB64單克隆抗體［4］及DNA微列陣技術序列分析［5］試驗進行確證。

結 果

1.藥敏結果：異煙肼（H）、鏈霉素（S）、乙胺丁醇（E）、阿米卡星（Am）、克拉霉素（Clr）、左氧氟沙星（Lfx）、莫西沙星（Mfx）、丙硫異煙胺（Pto）及對氨基水楊酸異煙肼（Pa）敏感，對利福平（R）和利福布汀（Rfb）耐藥。分枝桿菌初篩試驗：PNB陰性，TCH陽性，初步定性分枝桿菌為MTC。

2.菌型鑒定結果：（1）生物化學試驗：PNB、28℃和5%NaCl不生長；耐熱觸酶和吐溫－80水解試驗陰性；TCH和硝酸鹽還原試驗，以及尿素酶分解試驗陽性；在42℃高溫環境下生長，不過其培養基斜面生長的菌落數比對照管（37℃）稍微稀落。（2）確證試驗：MPB64單克隆抗體及DNA微列陣技術序列分析試驗均確證這2株耐高溫株為MTC株種。（3）驗證試驗：為確保實驗結果的可靠性，在進行生物化學鑒定和確證試驗的同時，與該例患者的2株菌株一起用H37Rv株作為對照參考試驗。

討 論

分枝桿菌不同菌群的生長發育與培養時的溫度關系甚為密切，其中大部分NTM基本能在25～42℃環境中生長［3］；但 MTC對生長溫度條件的要求則比較苛刻［6］，宜置35～37℃溫度條件下孵育，在30℃以下或40℃以上均不能生長或很難生長；此外MTC在規程中被歸類于“結核分枝桿菌菌群”，其與 NTM 在生物特性上有所不同［3］，其中RunyonⅠ、Ⅱ群基本為產色性株種，而RunyonⅣ群為快速生長型；但“結核分枝桿菌菌群”與RunyonⅢ群卻有一共同點，為不產色性和生長緩慢型，不同之處是后者基本能在28℃環境下生長，并有部分可在42℃高溫環境中裂殖［3］；因此分枝桿菌菌群初篩可利用色源性、生長速度及溫差將MTC與NTM兩者區別。

在規程中，同樣為不產色性和生長緩慢并在42℃高溫環境下生長的RunyonⅢ群分枝桿菌群有［3］：鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌和施氏分枝桿菌，其中前兩者能在28℃環境下裂殖，而后者只在37～42℃環境中生長；本研究中發現的2株耐高溫MTC株種生長所需溫度環境特性與施氏分枝桿菌一樣，同樣能在37～42℃環境中生長繁殖，這是MTC極為罕見的生物現象。因此這兩者的鑒別試驗非常重要。

筆者的體會是：吐溫－80水解試驗和尿素酶分解試驗是其區別的關鍵！雖然施氏分枝桿菌與絕大部分NTM一樣對PNB耐受，但有文獻報道［7］：5.21%的 MTC對PNB產生了耐藥性；此外施氏分枝桿菌的耐熱觸酶試驗陽性，但對H高度耐藥的MTC也呈耐熱觸酶試驗陽性的現象［8］；同時在規程中指出：MTC的硝酸鹽還原試驗大部分為陽性，可是牛分枝桿菌及部分非洲分枝桿菌與施氏分枝桿菌同樣為陰性。因此，一旦出現PNB和耐熱觸酶試驗陽性，以及硝酸鹽還原試驗陰性但為可疑MTC株種（如菌落為米黃色、形態粗糙呈菜花樣，培養物涂片抗酸染色呈典型索條狀，以及對一線抗結核藥物敏感）者［7，9］，吐溫－80水解試驗和尿素酶分解試驗將是其與施氏分枝桿菌區別的惟一關鍵實驗，因后者吐溫－80水解試驗陽性而尿素酶分解試驗陰性。

作者單位：510095廣州市胸科醫院呼吸疾病國家重點實驗室（結核病研究室）

此外，本研究結果表明：該2株耐高溫MTC株僅對R和Rfb耐藥，而對臨床上其他使用的常規抗結核藥物敏感，因而菌株的耐高溫特性與藥物耐藥與否沒有因果關系；同時患者在入院前后有低熱而未見39℃或以上的高體溫現象，從而也表明該2株耐高溫MTC株未曾有在39℃或以上高溫環境下生存過的條件，因而菌株的耐高溫特性也似乎與此沒有因果關系。

綜合上述分析，筆者認為：該2株菌株經生物化學試驗和確證試驗后完全符合“結核分枝桿菌菌群”的所有特征，但其能在42℃高溫環境下生長，這與典型的“結核分枝桿菌菌群”又有著巨大的差異，且在同一患者同時分離出2株能耐高溫的Mtb株種，筆者檢索了有關資料（根據萬方醫學網和中國知網等中文數據庫檢索），未見有關類似的報道。這是否提示Mtb群序列排列有所改變？是今后值得我們研究的課題。

［1］吳龍章，陳素穎，曾少芳，等.廣州市12年間分枝桿菌菌型與藥物敏感性結果變遷的分析.中華預防醫學雜志，2011，45（1）：26－29.

［2］吳龍章，蔡杏珊，關玉華，等.66例非結核分支桿菌肺病的臨床分析.中國防癆雜志，2003，25（4）：257－259.

［3］中國防癆協會基礎專業委員會.結核病診斷實驗室檢驗規程.北京：中國教育文化出版社，2006：30－96.

［4］顧欣榮，陳俊林，顧德林，等.MPB64抗原檢測對分枝桿菌菌型快速鑒別的價值探討.江蘇預防醫學，2009，20（3）：34－35.

［5］劉晶波，樂軍，韓敏，等.應用微列陣技術快速鑒定常見致病性分枝桿菌.中華臨床感染病雜志，2010，3（1）：44－47.

［6］郭鈞，孟昭赫.結核病細菌學.沈陽：遼寧科學技術出版社，1983：23－28.

［7］吳龍章，潘美玉，劉欣，等.結核分枝桿菌對對硝基苯甲酸耐藥性的研究.中華結核和呼吸雜志，2011，34（2）：117－119.

［8］吳龍章，鐘炳棠，劉燕文，等.對《結核病診斷細菌學檢驗規程》的一點看法.中國防癆雜志，2012，34（3）：192－193.

［9］吳龍章，蔡杏珊，譚守勇.試管內藥物抑制分支桿菌生長的觀察.廣東醫學，2001，22（6）：512－513.

2012－05－18）

（本文編輯：張曉進）

廣東省科技廳（2012A030400035）；廣州市醫藥衛生科技項目（20121A011082）