抗人DR5單克隆抗體誘導 Jurkat和 U937細胞凋亡的線粒體信號通路①

李淑蓮 蔡 靜 張舒曼 劉廣超 馬遠方

(河南大學細胞與分子免疫學重點實驗室河南大學免疫學研究所，開封475004)

腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(Tumor necrosisfactorrelated apoptosisinducing ligand，TRAIL)為TNF家族的成員之一，TRAIL有5種受體，4種膜結合受體(TRAIL-R1/DR4、TRAIL-R2/DR5、TRAIL-R3/DcR1、TRAIL-R4/DcR2)和 1 種可溶性受體 OPG［1］，其中 TRAIL-R1/DR4 和 TRAIL-R2/DR5胞內段含有“死亡結構域(Death domain，DD)”［2，3］。TRAIL 與 DR4/DR5 結合后，能夠激活死亡受體通路及線粒體通路誘導多種腫瘤細胞凋亡［4-6］，在臨床試驗中也顯示出較好的抗腫瘤活性，但是肝細胞損害及一些腫瘤細胞對TRAIL誘導凋亡的抵抗等原因，一定程度上阻礙了 TRAIL的應用［7，8］。

近年研究發現，一些抗DR4/DR5的激活型抗體能夠模擬TRAIL的作用，有效誘導腫瘤細胞凋亡，并且無 TRAIL 的肝細胞毒性［9，10］。本實驗室成功研制一株抗人DR5激活型抗體-mDRA-6，前期實驗表明，mDRA-6與細胞膜DR5結合，能夠有效激活caspase-8等死亡受體途徑信號分子，誘導多種腫瘤細胞凋亡［11］，但mDRA-6誘導腫瘤細胞凋亡過程中，是否有線粒體通路信號分子的激活尚不清楚，為了更全面研究mDRA-6誘導腫瘤細胞凋亡機制，本實驗在白血病細胞系Jurkat和U937細胞上，探討mDRA-6對腫瘤細胞線粒體通路信號分子的激活改變，為其臨床抗腫瘤應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料 鼠抗人DR5單克隆抗體mDRA-6由本實驗室制備;Jurkat細胞株由美國賓夕法尼亞大學醫學院陳有海教授饋贈，U937細胞購于中國醫學科學院上海細胞生物研究所;RPMI Medium 1640購于Gibco公司;胎牛血清購于天津TBD公司;四氮唑藍(MTT)、DMSO購自Sigma公司;FITC-AnnexinV/PI試劑盒購自BD公司;Western細胞裂解液購自Beyotime公司;caspase-9抑制劑 Z-LEHD-FMK及caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK購于RD公司;山羊抗人 caspase-9抗體、兔抗人 caspase-3抗體購自R＆D公司;兔抗人Bcl-xl抗體購自Cell Signaling公司;兔抗人Bcl-2抗體、鼠抗人Bax、actin抗體購自Beyotime公司;山羊抗人Cytc單克隆抗體購自Santacruz公司;辣根過氧化酶標記羊抗鼠-HRP、羊抗兔-HRP及兔抗山羊IgG(H+L)購自北京中杉金橋公司;ECL顯影試劑盒購自Amershem Pharmacia公司。PVDF膜購自Milipore公司;流式細胞儀(FACSCalibur)為BD公司產品;垂直電泳儀及電轉裝置為Thermo EC公司產品;凝膠圖像分析儀(Alphalmager2200)為Alpha Inntech公司產品。

1.2方法

1.2.1mDRA-6對Jurkat及U937細胞生長增殖抑制作用 分別收集對數生長期的Jurkat和U937細胞，加入96孔培養板，細胞密度為3×104/孔，分別以不同濃度 (10、5、2.5、1.25、0.64、0.32、0.16 mg/L)的mDRA-6培養細胞10小時，或用終濃度為10 mg/L 的 mDRA-6 分別處理細胞 1、2、4、6、8、10小時。更換新培養液，加入MTT(5 mg/L)20 μl/孔，繼續培養4小時。離心，吸棄上清，每孔加入150 μl DMSO，振蕩混勻，全自動酶標儀測OD570值。每一實驗濃度設3個復孔，實驗重復3次。按以下公式計算細胞生長抑制率，細胞生長抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值) ×100%。

1.2.2DNA ladder檢測mDRA-6對細胞的凋亡作用 調整Jurkat及U937細胞濃度為1×107/瓶，加入終濃度為10 mg/L的 mDRA-6，置于37℃ 5%CO2培養箱內孵育2小時，陰性對照為相同濃度的小鼠IgG1。收集細胞，800 r/min離心5分鐘，棄上清，PBS洗細胞2次。提取細胞DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外下觀察并拍照。

1.2.3Western blot檢測凋亡信號分子變化 取對數生長期的Jurkat及U937細胞，加終濃度為10 mg/L的mDRA-6，分別培養0分鐘、5分鐘、15分鐘、30分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時后收集細胞，用預冷PBS洗細胞2次，加細胞裂解液(20 mmol/L HEPES pH7.5，0.35 mmol/L NaCl，20%甘油，1%NP-40，1 mmol/L MgCl2·6H2O，0.5 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L EGTA，1 mmol/L PMSF)冰上裂解30分鐘，10 000 r/min離心15分鐘，收集上清，用BCA法檢測上清液蛋白濃度，取細胞總蛋白60 μg，進行SDSPAGE電泳，并轉移PVDF膜。用含有5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉PVDF膜1小時，洗滌4次，分別加入抗人 caspase-9、caspase-3、bax、bcl-2、bcl-xl及Cyt c抗體，室溫孵育2小時，洗滌4次。將膜封閉于HRP標記的二抗稀釋液中，室溫孵育1小時，TBST洗膜后，ECL反應液中反應1分鐘，暗室顯影。

1.2.4Caspase-9、3抑制劑對mDRA-6抑制細胞生長增殖的影響 收集Jurkat和U937細胞，接種于96孔板中，細胞密度為3×104細胞/孔，分別加入終濃度為15 μmol/L的caspase-9、3抑制劑，對照組加入同體積的 RPMI1640完全培養液。置37℃ 5%CO2培養箱內孵育1小時后，加入終濃度為10 mg/L的 mDRA-6，終體積為 200 μl/孔，置于37℃ 5%CO2培養箱內孵育8小時。每一濃度設3個復孔，實驗重復3次。上述MTT法檢測細胞生長抑制率。

1.2.5Caspase-9抑制劑對mDRA-6誘導細胞凋亡的影響 分別制備Jurkat和U937細胞懸液，加入24孔培養板，細胞數為3×105/孔，分別加入終濃度為15 μmol/L的 caspase-9抑制劑，終體積為1 ml/孔，對照組加入同體積的RPMI1640完全培養液。37℃孵育1小時后，加入終濃度為10 mg/L的mDRA-6，置37℃ 5%CO2培養箱內孵育細胞2小時。收集細胞，用結合液洗細胞2次，并將細胞懸浮于100 μl標記液中，加 FITC-AnnexinV/PI染液各5 μl，混勻后避光冰浴15分鐘，流式細胞術檢測細胞凋亡率。Cellquest軟件分析細胞凋亡率。

1.3統計學分析 實驗數據用±s表示，組間t檢驗進行統計學分析，P＜0.05認為有統計學差異。

2 結果

2.1mDRA-6對Jurkat及U937細胞生長增殖影響

不同劑量(10、5、2.5、1.25、0.64、0.32、0.16 mg/L)的mDRA-6孵育Jurkat及U937細胞10小時，兩種細胞均呈現濃度依賴性地生長抑制;10 mg/L的mDRA-6也呈時間依賴性地抑制Jurkat及 U937細胞的生長增殖，10 mg/L的 mDRA-6孵育 Jurkat細胞6、8和10小時，細胞增殖抑制率分別達59.38%、72.56%和76.28%;10 mg/L的mDRA-6孵育U937細胞6、8和10小時，細胞增殖抑制率分別達38.67%、47.54%和50.59%，見圖1。

2.2DNA ladder檢測mDRA-6對Jurkat及U937細胞的凋亡作用 10 mg/L的mDRA-6作用Jurkat及U937細胞2小時，提取細胞DNA，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示，mDRA-6處理的 Jurkat及U937細胞均呈現凋亡細胞所特有的DNA ladder條帶，而對照組細胞無梯形圖譜產生，結果見圖2。

圖1 mDRA-6對Jurkat和U937細胞的生長抑制作用Fig．1 Inhibition of mDRA-6 on Jurkat and U937 cells

2.3Western blot檢測細胞凋亡分子 mDRA-6作用后，Jurkat和U937細胞內的凋亡分子發生變化。隨著mDRA-6作用時間延長，Jurkat和U937細胞內的促凋亡分子bax激活增多，Cyt c釋放增多，而同時細胞抗凋亡分子bcl-2及bcl-xl隨mDRA-6作用時間延長不斷減少。mDRA-6作用后，Jurkat和U937細胞內34 kD的caspase-9裂解片段明顯增多;Jurkat和U937細胞caspase-3也顯示明顯的激活表現，Jurkat細胞 caspase-3激活尤為顯著，10 mg/L的mDRA-6作用Jurkat細胞5分鐘，Jurkat細胞caspase-3即有17 kD的裂解條帶顯示，且隨著mDRA-6作用時間延長，12 kD的裂解片段明顯呈現。結果見圖3。

圖2 DNA梯形條帶分析Fig．2 DNA ladder analysis

圖3 mDRA-6激活Jurkat及U937細胞凋亡分子Fig．3 Appototic molecule activation in Jurkat and U937 cells treated with mDRA-6

2.4Caspases-9、3抑制劑對mDRA-6抑制細胞生長增殖的影響 Caspase-9、3抑制劑能夠不同程度降低mDRA-6對Jurkat和U937細胞的生長抑制作用。預先使用caspase-9、3抑制劑孵育細胞1小時，mDRA-6所致Jurkat細胞生長抑制率分別降低了24.36%(t=5.44，P＜0.01)和31.18%(t=7.97，P＜0.01);mDRA-6所致U937細胞生長抑制率分別降低了20.82%(t=4.29，P＜0.01)和50.20%(t=12.98，P＜0.01)。Caspase-9、3抑制劑單獨使用，對Jurkat和U937細胞生長增殖無明顯影響，結果見圖4。

圖4 Caspases抑制劑對mDRA-6抑制Jurkat及U937細胞生長的影響Fig．4 The effects of caspases inhibitors on cell inhibition ratio of Jurkat and U937 traeted with mDRA-6

2.5Caspase-9抑制劑對mDRA-6誘導細胞凋亡的影響 AnnexinⅤ/PI雙染，流式細胞術檢測結果表明，10 mg/L的mDRA-6作用Jurkat和U937細胞2小時，細胞凋亡率分別為66.64%和38.50%。預先用15 μmol/L的 caspase-9抑制劑孵育 Jurkat或U937細胞1小時，mDRA-6誘導的細胞凋亡率分別降低了32.89%和23.97%。15 μmol/L的caspase-9抑制劑對Jurkat和U937細胞無明顯凋亡作用，結果見圖5。

3 討論

TRAIL與細胞膜上的相應受體(TRAIL-R1/DR4，TRAIL-R2/DR5)結合，啟動胞外凋亡通路(死亡受體通路)和胞內凋亡通路(線粒體通路)，誘導多種腫瘤細胞凋亡。TRAIL與含有死亡結構域(Death domain，DD)的細胞膜DR4或DR5結合，通過銜接蛋白 FADD(Fas associated death domain，FADD)，激活caspase-8/caspase-10，啟動外源性凋亡途徑導致細胞凋亡［4，5］。

TRAIL胞內凋亡通路是線粒體依賴性的凋亡通路，受Bcl-2蛋白家族中促凋亡因子和抗凋亡因子相互調控，二者的平衡對于調節線粒體功能有重要價值。胞內凋亡通路主要的促凋亡成員Bax和Bak通過破壞線粒體膜的完整性發揮作用，bax是bcl-2家族的重要的促凋亡蛋白，在正常細胞中主要分布在胞質，在TRAIL等多種凋亡刺激因子的作用下，可以發生轉位與線粒體相互作用，損傷線粒體造成線粒體膜電位變化，導致線粒體內某些促凋亡分子，如Cyt c等外流，進而活化caspase-9，激活效應caspases分子，啟動細胞凋亡過程。抗凋亡成員bcl-2和bcl-xl在線粒體外膜發揮作用，bcl-2和bcl-xl可以和bax等結合形成異構二聚體，阻止bax對線粒體的損傷，以維持線粒體膜的完整性，抑制細胞凋亡。bax表達水平增加可拮抗bcl-2的作用，并促進細胞凋亡［12］。

圖5 Caspases-9抑制劑抑制mDRA-6誘導的Jurkat/U937細胞凋亡Fig．5 Caspases-9 inhibitor inhibit the apoptosis of Jurkat and U937 cells treated with mDRA-6

研究表明激活型抗DR5抗體能夠通過死亡受體通路，激活 caspase級聯反應，啟動細胞凋亡［13，14］。本實驗中我們發現，激活型抗 DR5 抗體mDRA-6呈濃度、時間依賴性地誘導Jurkat和U937細胞凋亡，同時細胞內線粒體通路主要凋亡分子bax表達隨mDRA-6作用時間而增多，而主要抗凋亡分子bcl-2及bcl-xl隨mDRA-6作用時間而減少，提示線粒體通路可能參與了mDRA-6誘導的細胞凋亡，為了進一步明確線粒體通路的激活，我們應用Western blot方法，檢測線粒體釋放的凋亡因子Cyt c變化，結果發現mDRA-6作用Jurkat細胞15分鐘，即可檢測到Cyt c釋放，并隨mDRA-6作用時間延長而增多;mDRA-6作用U937細胞也顯示有Cyt c釋放增多。線粒體釋放的Cyt c等凋亡因子，能夠使細胞procaspase-9自身催化形成有活性的caspase-9，隨后激活下游caspase-3等效應caspases分子，導致細胞凋亡。caspase-9激活是線粒體通路激活的重要環節，本實驗中 Western blot檢測發現，mDRA-6作用Jurkat及U937細胞后，細胞caspase-9、caspase-3均有激活片段產生，且預先應用caspase-9抑制劑能夠有效抑制mDRA-6所致的Jurkat及U937細胞凋亡率，進一步表明線粒體通路激活是mDRA-6誘導Jurkat及U937細胞凋亡的重要機制之一。

抗人DR5的激活型單克隆抗體具有TRAIL的誘導腫瘤細胞凋亡作用，又克服了TRAIL的受體多樣性及肝細胞毒性作用，可能較TRAIL有更好的抗腫瘤應用前景。本實驗中的抗DR5單克隆抗體mDRA-6，能夠有效誘導白血病Jurka及U937細胞凋亡，細胞線粒體通路激活是其誘導細胞凋亡的機制之一。對mDRA-6誘導腫瘤細胞凋亡機制的進一步研究，可能對提高mDRA-6抗腫瘤臨床應用提供有用的理論基礎。

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