Annexin A2基因沉默對肺癌細胞轉移能力的影響①

高 昕 王述民 曲家騏 劉 博 (沈陽軍區總醫院胸外科，沈陽110016)

Annexin家族是一類鈣依賴性膜磷脂結合蛋白，參與膜轉運及膜表面一系列依賴于鈣調蛋白的活動，包括鈣離子通道的形成、調控炎癥反應、纖溶、胞吐、胞吞、細胞增殖、DNA修復合成、細胞分化與凋亡、細胞骨架活動、成骨細胞的形成和骨的重吸收、膜功能區的形成、信號轉導等［1］。廣泛存在于核內、胞質、細胞質膜下、儲Ca2+細胞器附近及細胞外基質中，約占細胞總蛋白的2%。Annexin A2是家族中的一個重要成員，在腫瘤的侵襲轉移中發揮重要作用［2，3］。本研究擬探討 Annexin A2基因沉默對肺癌細胞轉移能力的影響，進一步明確肺癌轉移中相關分子機制，以期為肺癌的基因治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM及1640培養基購于美國Gibco公司。胎牛血清購于四季青生物工程有限公司。逆轉錄、rTaq DNA聚合酶、dNTP、限制性核酸內切酶和DL2000試劑購于日本TaKaRa公司。質粒抽提試劑盒購于美國Axygen公司。Trizol及LipofectamineTM2000購于美國Invotrigen公司。單克隆鼠抗人Annexin A2抗體購于美國Diagnostica公司。生物素化的兔抗鼠IgG購于美國Sigma公司。A549，SPC-1-A，95D和95C肺癌細胞由本院呼吸實驗室室保存。真核細胞載體psilencer-Annexin A2由哈爾濱醫科大學黃昀博士惠贈。抗磷酸化的mTOR多克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司;抗β-actin單克隆抗體購于晶美生物工程有限公司;HRP標記二抗體和FITC標記二抗購于北京中山公司;ECL化學發光試劑盒購于美國Amersham公司;Transwell小室購于丹麥Costar Corning公司;瑞士姬姆薩染色液購于珠海貝索生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞系的培養 A549、95D、SPC-1-A和95C共4種肺腺癌細胞系均用含10%胎牛血清、1%雙抗和1.5%谷胺酰胺的RPMI1640培養基培養，在37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養，每2～3天傳代1次。

1.2.2明膠酶活性分析 應用金屬蛋白酶活性分析實驗進行體外培養細胞轉移能力分析。按1×104個細胞/每孔接種肺腺癌細胞于24孔培養板內。細胞貼壁后，棄去培養液，換成無血清RPMI1640培養基。培養24小時后，收集培養上清液，1 000 r/min，離心10分鐘，取上清液分裝，-20℃凍存。配制10%SDS-PAGE膠(含1%明膠)，作為分離膠，上層為6%的積層膠，以15 μl的細胞培養上清液上樣，150 V恒壓電泳1小時后，取出凝膠放入2.5%Triton-X100溶液中浸泡2小時，然后在明膠酶緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L NaCl，10 mmol/L CaCl2，pH7.5)中37℃孵育18小時，考馬斯亮藍染色，透射掃描儀掃描并存貯圖像，Bio-Rad凝膠成像軟件分析蛋白負染情況。

1.2.3Transwell細胞遷移實驗 棄去細胞培養基，PBS沖洗細胞2次，胰酶消化5分鐘，離心，棄上清，10%FCS的DMEM重懸細胞，反復吹打均勻，光鏡下用計數板進行細胞計數，取5×104個細胞于24孔板中的 Transwell(小孔內徑8 μm)上室，取500 μl含10%FCS的DMEM于Transwell下室，將含Transwell小室的24孔板置于37℃、含5%CO2的細胞培養箱中，6小時后取出，用棉簽擦去小室濾膜上層細胞，移行并粘附到濾膜下層面的細胞以瑞士姬姆薩染色液染色3～10分鐘，自來水沖洗，于低倍顯微鏡下(×10)觀察到移行的細胞核呈紫紅色，隨機觀察5個視野，計數移行細胞數，取均值，實驗重復3次。

1.2.4RT-PCR檢測 TRIzol一步法提取細胞總RNA，各取1 μg RNA 按 TaKaRa RNA PCR Kit說明書行cDNA合成及PCR擴增，同時以β-actin為內參照。基因Annexin A2引物序列如下(975 bp)：5＇-AAATGTCTACTGTTCACGAAATCC-3＇(正義鏈);5＇-GTGTCGGGCTTCAGTCATC-3＇(反義鏈)。對照基因β-actin 引物序列如下(250 bp)：5＇-ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3＇(正義鏈);5＇-CATACTCCTGCTTGCTGATCC-3＇(反義鏈)。

1.2.5細胞轉染 pSilencer-Annexin A2載體購于美國Ambion生物工程公司。Annexin A2轉錄起始點下游94～113 bp的21個堿基為目標片段。應用陽離子脂質體Lipofectamine2000將Annexin A2沉默載體分別轉染到高轉移細胞系A549和95D中，G418篩選2周后出現穩定表達轉染質粒的單細胞克隆株，分別命名為 A549-siAnnexin A2和 95D-siAnnexin A2。

1.2.6Western blot 將全細胞提取物進行SDSPAGE、轉膜、抗體結合及顯色。分離膠濃度為12%;一抗分別為抗 Annexin A2，mTOR和 β-actin抗體。經辣根過氧化物酶標記的二抗孵育后，按ECL試劑盒說明書曝光處理。

1.3統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件，采用單因素方差分析及Post Hoc組間比較，對實驗結果進行統計學分析，P＜0.05時，差異具有統計學意義。

2 結果

圖1 四種肺腺癌細胞中金屬蛋白酶的表達Fig．1 Expression of MMP in lung adenocarcinoma cells

2.1四種肺腺癌細胞中金屬蛋白酶的表達和細胞移行能力 四種肺腺癌細胞系的金屬蛋白酶的表達(圖1)，可見肺腺癌細胞系A549和95D中MMP-9的活性明顯高于95C和SPC-1-A細胞系(P＜0.01)。Transwell細胞遷移實驗表明(圖2)，肺腺癌細胞系A549和95D的遷移數目高于95C和SPC-1-A細胞系(P＜0.05)。

圖2 四種肺腺癌細胞遷移數目Fig．2 Cell migration numbers in lung adenocarcinoma cells

圖3 四種肺腺癌細胞中Annexin A2 mRNA的表達Fig．3 Expression of Annexin A2 mRNA in lung adenocarcinoma cells

2.2四種肺腺癌細胞中Annexin A2 mRNA及蛋白的表達 應用RT-PCR和Western blot分析檢測顯示，高轉移細胞系A549和95D中Annexin A2 mRNA(圖3)及蛋白(圖4)表達均明顯高于低轉移細胞系95C和SPC-1-A(P＜0.01)。

2.3沉默載體psilencer-Annexin A2轉染后A549和95D細胞的移行能力 Western blot分析顯示(圖5)，沉默載體psilencer-Annexin A2轉染后的A549-si和95D-si細胞中Annexin A2的表達較空載體(psilencer-blank)轉染的對照組A549-blk、95D-blk顯著下降(P＜0.01)。進一步觀察這兩個細胞模型的細胞遷移能力，Transwell遷移模型的結果發現(圖6)：與正常空質粒轉染對照組比較，Annexin A2沉默后，兩細胞系的遷移數目降低(P＜0.05)。

圖4 四種肺腺癌細胞中Annexin A2蛋白的表達Fig．4 Expression of Annexin A2 protein in lung adenocarcinoma cells

2.4肺腺癌細胞中mTOR蛋白的表達 應用Western blot分析表明(圖7)，與低轉移潛能細胞系相比較，在高轉移潛能的肺癌細胞中p-mTOR呈明顯高表達(P＜0.01)，而T-mTOR表達無明顯差異。Annexin A2基因表達被沉默后，細胞中p-mTOR表達也明顯下降(P＜0.01)。

圖6 沉默載體psilencer-Annexin A2轉染后，A549和95D細胞的遷移數目Fig．6 Cell migration numbers in A549 and 95D cells after psilencer-Annexin A2 transfection

圖7 肺腺癌細胞中mTOR蛋白的表達Fig．7 Expression of mTOR in lung adenocarcinoma cells

3 討論

具有局部浸潤和遠距離轉移能力是惡性腫瘤最重要的特點，也是惡性腫瘤致命的主要原因之一。因此，Annexin A2與惡性腫瘤這方面特性的關系的研究受到格外重視。Annexin A2與某些S100家族成員、組織型纖溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator，t-PA)、纖溶酶原(Plasminogen，PLG)及腱糖蛋白 C(Tenascin.C，TN-C)等相互作用［4］，使他們在腫瘤細胞表面共區域化，介導tPA依賴的纖溶酶的產生，激活蛋白酶前體，活化基質金屬蛋白酶、細胞外基質的重塑及蛋白質水解、新血管形成，促進腫瘤細胞浸潤轉移［5-7］。

我們分析了四種肺腺癌細胞系中基質金屬蛋白酶MMP-9的表達，MMP-9是細胞基質金屬蛋白酶家族中最重要的成員，可以直接參與對基底細胞膜的水解，影響細胞的粘附和轉移能力。結果表明肺腺癌細胞系A549和95D中MMP-9的活性明顯高于95C和SPC-1-A細胞系。同時，Transwell細胞遷移實驗也證實，腺癌細胞系A549和95D的遷移數目高于95C和SPC-1-A細胞系。上述結果證實，A549和95D細胞系具有較強的轉移潛能。另外，Annexin A2基因在高轉移細胞系A549和95D中均呈現高表達狀態。這些高表達的Annexin A2在細胞表面作為PLG和t-PA的共同受體，加速了PLG的生成，PLG通過促進金屬蛋白酶(MMPs)和潛在生長因子(Latent growth factor，LGF)的活化、膜蛋白的水解、細胞外基質的降解等加速血管生成，促進腫瘤的浸潤和轉移。進一步應用RNA干擾的方法抑制了Annexin A2基因的表達，使A549和95D細胞的遷移能力顯著下降。以上結果說明Annexin A2具有促肺癌細胞增殖和侵襲的作用，從而促進肺癌的發生和發展。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一個289 kD的高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于 PI3K相關激酶家族(Ptdlns3K-related kinase family)。mTOR對細胞的代謝、生長、增殖、生存和細胞骨架運動等生物過程的調節起著重要的調控作用。研究發現mTOR信號通路參與了腫瘤的形成、血管新生、胰島素抵抗、脂肪形成、T淋巴細胞激活等過程［8］。由于與腫瘤密切相關，mTOR成為腫瘤治療的一個重要靶點。雷帕霉素是mTOR的特異性抑制劑，可以抑制腫瘤細胞的增殖，與其他的化療藥物聯合應用有望獲得更好的治療效果，但只有mTOR通路在腫瘤中起到重要作用時，該類藥物才會表現較好的療效［9］。磷酸化的mTOR(p-mTOR)是mTOR在信號通路中的激活狀態。因此本實驗選取p-mTOR作為研究指標，結果顯示，在高轉移細胞系中p-mTOR呈明顯高表達;在沉默了 Annexin A2表達后，細胞中 p-mTOR的活性明顯受到抑制。二者表達的密切相關提示了Annexin A2可能是通過激活了細胞內的mTOR信號通路，參與了肺癌細胞轉移的發生，但具體的分子機制仍有待進一步研究闡明。

綜上所述，本研究結果提示Annexin A2在肺癌轉移過程中起關鍵作用，為闡明腫瘤侵襲轉移分子機制、分子靶向治療及預后評估方面，提供了新思路。抑制其表達或阻斷其介導的信號轉導通路將有可能為抗腫瘤治療提供一些較為理想的思路。隨著基因剔除和剔減技術的興起，人們正在進一步揭示Annexin A2與腫瘤發展進程的相關性，但其在腫瘤的發生、浸潤、轉移過程中的具體作用機制尚有待于進一步探索和拓展。相信隨著該基因與惡性腫瘤發展關系的深入研究，它有望被開發為用于肺癌及其轉移的早期檢測、輔助診斷及治療的靶分子。

1 Chasserot-Golaz S，Vitale N，Umbrecht-Jenck E et al．Annexin 2 promotes the formation of lipid microdomains required for calciumregulated exocytosis of dense-core vesicles［J］.Mol Biol Cell，2005;16(3)：1108-1119.

2 Huang Y，Jin Y，Yan C H et al．Involvement of Annexin A2 in p53 induced apoptosis in lung cancer［J］.Mol Cell Biochem，2008;309(1-2)：117-123.

3 Zhao P，Zhang W，Tang J et al．Annexin II promotes invasion and migration of human hepatocellular carcinoma cells in vitro via its interaction with HAb18G/CD147［J］.Cancer Sci，2010;101(2)：387-395.

4 Hou Y，Yang L，Mou M et al．Annexin A2 regulates the levels of plasmin，S100A10 and Fascin in L5178Y cells［J］.Cancer Invest，2008;26(8)：809-815.

5 章藹然，潘 寧，侯穎春et al.膜聯蛋白A2與惡性腫瘤發展進程的關系［J］.細胞生物學雜志，2008;30(3)：307-311.

6 Semov A，Moreno M J，Onichtchenko A et al．Metastasis-associated protein S100A4 induces angiogenesis through interaction with Annexin II and accelerated plasmin formation［J］.J Biol Chem，2005;280(21)：20833-20841.

7 Mackie E J.Molecules in focus：tenascin-C［J］.Int J Biochem Cell Biol，1997;29(10)：1133-1137.

8 Laplante M，Sabatini D M.mTOR signaling at a glance［J］.J Cell Sci，2009;122(20)：3589-3594.

9 Chan S，Scheulen M E，Johnston S et al．Phase II study of temsirolimus(CCI-779)，a novel inhibitor of mTOR，in heavily pretreated patients with locally advanced or metastatic breast cancer［J］.J Clin Oncol，2005;23(23)：5314-5322.