轉錄因子活化蛋白-1在顳葉癲癇模型小鼠海馬的表達變化

李 艷 趙旭東 (重慶醫科大學中醫藥學院，重慶401331)

癲癇的特點是腦部有持續存在的癲癇反復發作的易感性以及由于這種疾病引起的神經生化、認知、心理和社會后果。目前，癲癇發病機制尚不清楚。研究表明［1，2］，炎性反應可以激發大量炎癥因子釋放，擾亂神經通路，影響神經傳導，對于癲癇發作的持續存在是必需的。然而，癲癇患者炎癥反應發病機制尚不清楚。近年來，越來越多研究表明，轉錄因子活化蛋白-1(Transcription factor activator protein-1，AP-1)激活是細胞炎癥反應關鍵轉錄因子［3，4］，其表達異常可引起嚴重炎癥反應，擾亂神經通路，影響神經傳導，損傷組織，進一步引發各種神經病理癥狀。故推測，AP-1可能通過炎癥反應在癲癇發病中發揮一定作用。鑒于KA所誘導的小鼠癲癇模型在病理學和行為學上的相似性，并且伴隨著海馬錐體神經元的損傷等特點，因此成為研究人類癲癇的理想動物模型［5］。本實驗觀察了海人酸(Kainic acid，KA)側腦室注射誘導的癲癇(Epilepsy，EP)小鼠海馬AP-1表達，以探索AP-1異常表達在癲癇發病機制中所起作用。

1 材料與方法

1.1材料 C57小鼠(32只)，飼養條件：溫暖(20℃)，避強光、避噪音，單籠自由進食和飲水。按照完全隨機數字表法將實驗動物分成模型組(24只)和對照組(8只)，模型組再按照不同處死時間分為造模后3、8、24小時，每組8只。海人酸(Kain-ic acid，KA;Sigma公司)，兔抗小鼠AP-1抗體(Santa Cruz公司)，生物素化山羊抗兔二抗(博士德公司，武漢)，腦立體定向注射儀(深圳瑞沃德公司)。

1.2方法

1.2.1建立小鼠癲癇模型 模型組小鼠側腦室注射KA，分別于術后3、8、24小時觀察。以3.6%水合氯醛360 mg/kg腹腔注射將小鼠麻醉后，將其頭部固定在立體定向儀上，常規備皮、消毒，沿頭部正中線切開頭皮、暴露前囟。根據小鼠腦立體定向圖譜定位側腦室(前囟后0.4 mm，右側旁開1.3 mm)，鉆直徑為1.0 mm的一個圓孔，深度達硬腦膜表面，注意盡量不傷及腦組織。將預先裝有KA的微量進樣器沿鉆孔進針，深度達1.7 mm時向側腦室內緩慢注射1 μg/μl KA溶液1 μl(10分鐘內勻速注射完畢)，留針5分鐘后拔除穿刺針，用骨蠟封閉顱骨鉆孔，縫合頭皮，放回籠中進行行為學觀察。按照Racine分級［5］判斷癲癇發作程度，Ⅲ級以上為成功動物模型。如果造模失敗，則用相同數量動物補充造模。對照組用等體積生理鹽水代替KA行側腦室注射。

1.2.2RT-PCR檢測AP-1 mRNA轉錄水平 分別于術后3、8、24小時對麻醉后小鼠斷頭取腦，分離海馬組織。用Trizol法(Trizol試劑盒，天根公司)按說明書提取總RNA。總RNA純度和濃度使用紫外分光光度計(NanoPhotometer，Germany)測定，經測定所用樣品的A260/A280比值都在1.8～2.0之間。反轉錄過程也按試劑說明書進行操作。應用Prime premier 5.0軟件設計AP-1和內參GAPDH基因引物。引物由上海英駿生物公司合成。引物序列如下：AP-1上游引物為 5＇CCCACCCAGTTCTTGTGCC3＇;AP-1 下游引物為5＇TGTTCTGGCTATGCAGTTCAGC3＇;擴增片段為97 bp，GAPDH上游引物為5＇GCATTGTGGAAGGGCTCA3＇;GAPDH上游引物為5＇AAGGTGGAAGAGTGGGAGT3＇;擴增片段為 379 bp。

PCR循環條件為：94℃ 預變性2分鐘，94℃ 變性30秒，60℃退火30秒，72℃ 延伸2分鐘，35個循環后于72℃ 延伸10分鐘。PCR反應產物的大小分別為97 bp(AP-1)和379 bp(GAPDH)，PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，gold view染色。使用紫外光凝膠照像，經Image軟件進行灰度測定，實驗重復3次。將AP-1的灰度值與GAPDH灰度值的比值進行分析。

1.2.3Western blot檢測AP-1蛋白表達情況 分別于術后3、8、24小時對麻醉后小鼠斷頭取腦，分離海馬組織。將沖洗干凈的海馬組織置于含有2 ml蛋白提取緩沖液、蛋白酶抑制劑cocktail(Roche)的2 ml的勻漿器中，研磨，收集研出液。冰水混合物孵育10分鐘后，4℃、12 000 r/min離心10分鐘，取上清分裝，-80℃保存。將蛋白樣本與5×SDS上樣液混合后，100℃煮沸5分鐘，加入上樣孔，130 V恒壓電泳約2小時，PVDF膜轉膜100 mA，30分鐘、5%脫脂奶粉封閉37℃，1小時，加入兔抗小鼠AP-1抗體(1∶1 000)，4℃過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶3 000)，37℃、1小時。TBST充分洗滌后，用化學發光試劑盒(Thermo)進行曝光。使用Bio-rad發光成像儀分析與采集發光信號強度。

1.2.4免疫組化檢測AP-1在海馬表達水平 分別于術后3、8、24小時對麻醉后小鼠斷頭取腦。用4%多聚甲醛緩沖液固定后，進行石蠟包埋，在視交叉前端大腦和背側海馬處連續切片，切片厚4 μm。先用檸檬酸鹽抗原修復液(pH=6.0)，在高壓鍋內進行抗原熱修復，進行免疫組織化學染色一抗是兔抗小鼠AP-1抗體單克隆抗體(Santa cruz)，使用生物素化山羊抗兔二抗(博士德公司)，室溫孵育10分鐘;滴加辣根酶室溫孵育20分鐘;DAB顯色，室溫5分鐘，顯微鏡觀察顯色效果。染色結果判斷標準采用選擇相同區域、相同條件下用image進行光密度分析。

1.3統計學方法 采用SPSS13.0軟件包進行統計學分析，計量資料以±s表示，依據實驗數據類型作方差分析和相關分析，以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1小鼠行為學觀察結果 模型組小鼠在KA側腦室注射3小時后出現明顯反復發作的咀嚼、面部抽搐、肢體陣攣、身體背曲、尾部翹起、陣發性旋轉、站立跌倒、后退等癲癇發作癥狀。每次發作數秒至10余秒，反復間歇性發作數小時，8小時后逐漸恢復到正常狀態，24小時仍有發作，以Ⅱ～Ⅲ級發作為主。對照組小鼠無上述癇樣發作。

2.2癲癇發作小鼠及對照組各時間RT-PCR檢測AP-1 mRNA轉錄水平 應用PCR進一步證實AP-1在術后3、8、24小時，癲癇小鼠海馬組織中的轉錄強度。圖1顯示，AP-1條帶位于97 bp左右，與預期產物大小保持一致。術后3、8、24小時，癲癇小鼠海馬AP-1表達皆上升(P＜0.05)，其中術后8h時表達最高(P＜0.01)，術后24小時時趨于降低，但是仍高于正常對照組(P＜0.05，見圖1)。

2.3癲癇發作小鼠及對照組各時間點Western blot檢測AP-1蛋白表達情況 應用Western blot進一步證實AP-1在術后3、8、24小時，癲癇小鼠海馬組織中的蛋白表達強度。圖2顯示，AP-1條帶位于43 kD左右，與預期產物大小保持一致。術后3、8、24小時，癲癇小鼠海馬AP-1表達皆上升(P＜0.05)，其中術后8小時時表達最高(P＜0.01)，術后24小時時趨于降低，但是仍高于正常對照組(P＜0.05，見圖2)。

圖1 RT-PCR檢測基因AP-1在各組小鼠海馬的表達Fig．1 mRNA expression of AP-1 in the hippocampal of mouse in each group

2.4癲癇發作小鼠及對照組各時間點免疫組化檢測AP-1在海馬表達水平 應用免疫組織染色化學方法對癲癇發作小鼠及對照組各時間點AP-1在海馬表達組織可中變化進行檢測發現，NS組海馬極少見到棕黃色顆粒沉積，提示正常海馬細胞內AP-1表達很少。而模型組海馬可見有大量棕黃色顆粒沉積，提示癲癇小鼠海馬AP-1表達上升。而這些表達主要集中于海馬CA1區。特別是術后8小時，海馬可見有大片棕黃色顆粒沉積，提示術后8小時，癲癇小鼠海馬AP-1表達最高。各組間細胞形態未見明顯差異。結果表明，術后3、8、24小時，癲癇小鼠海馬AP-1蛋白表達上升，術后8小時時表達最高，24小時有所下降(見圖3)。

3 討論

圖2 Western blot檢測蛋白AP-1在各組小鼠海馬的表達Fig．2 Protein expression of AP-1 in the hippocampal of mouse in each group

圖3 AP-1在各組小鼠海馬的免疫組化表達Fig．3 Immunohistochemistry staining of AP-1 in the hippocampal of mouse in each group

中國約有 900萬癲癇患者，其中約600萬是“活動性癲癇”患者，同時每年新增癲癇患者約40萬，癲癇患者的死亡危險性為一般人群的2～3倍［7］。盡管現在有很多藥物可以治療癲癇，但是目前的抗癲癇藥對1/3的患者沒有作用［8］，可見了解癲癇的發病機制是治療癲癇的根本目標。雖然癲癇的病因和發病機制至今不明，但是近十年來，越來越多的臨床和實驗證據證實，腦內的炎癥過程可以損傷神經細胞，影響神經傳導，可能是癲癇發作的一個常見而有決定性的病理機制［3］。目前研究發現，多種細胞因子如TNF-α、IL-8、IL-6等都參與了癲癇炎癥過程［9］。Maroso 等［10］研究認為 IL-1β 和高遷移率族蛋白B1分別與IL-1R1和Toll樣受體4結合，通過級聯信號的放大作用激活轉錄因子核因子κB途徑，激活的核因子κB進入細胞核與相應靶序列結合，調節相關靶基因的轉錄活性，參與炎性反應、免疫反應、細胞凋亡等過程。這個轉錄途徑調節的相關炎性因子基因表達增強，引起海馬神經元的損傷［11］。炎性介質可以增加血管的通透性，使血清蛋白進入腦內影響離子緩沖能力，增強周圍神經興奮性和抑制膠質細胞攝取谷氨酸，從而引起神經元的過度興奮。進一步可引發癲癇等一系列神經系統病理癥狀。然而，癲癇患者中樞炎癥反應發病機制目前尚不清楚。

研究證實，炎癥介質大多受轉錄因子的調控，轉錄因子尤其AP-1可以調節細胞炎性因子基因表達，導致炎癥持續和發展，進而影響疾病的嚴重程度和對治療的反應［12］。AP-1是由c-fos和c-jun蛋白組成的同源或異源二聚體。靜息狀態下，AP-1的蛋白濃度和活性極低，分子結構以c-jun同源二聚體為主。當細胞受到刺激時，c-jun、c-fos表達水平增高，并轉變為以c-fos、c-jun異源二聚體為主的存在形式，DNA連接和誘導轉錄能力也迅速提高，促進細胞因子的轉錄合成。Bobrovnikova-Marjon等［3］用AP-1蛋白的突變形式封閉AP-1活性后，發現IL-8的表達明顯受到抑制。因此，AP-1表達異常可引發異常炎癥反應，從而進一步損傷神經系統，引發各種神經系統癥狀。然而，癲癇患者中樞炎癥反應是否與AP-1表達異常相關，目前尚無相關報道。

海人酸側腦室注射可引起小鼠癲癇癥狀，為動物癲癇經典模型。已有研究表明，海人酸(Kainic acid，KA)在PC12離體神經細胞死亡的同時伴有AP-1表達上升［11］，而抑制其激活則可降低神經細胞死亡［12］，這些給我們的提示，AP-1在神經細胞神經毒性激活情況下，可能參與了癲癇的發生與發展。本實驗通過對KA側腦室注射引發小鼠癲癇模型海馬AP-1在術后3、8、24小時后AP1的基因和蛋白表達趨勢的觀察后發現，AP-1在癲癇小鼠海馬表達在術后3小時即開始明顯上升，8小時達到高峰，24小時又開始趨于下降，但仍高于對照組。說明AP-1高表達與癲癇發病間可能具有密切關系。并且分布表達變化主要以海馬CA1區為主，可能作為CA1區海馬神經元興奮的重要炎性標志之一。但本實驗屬于觀察性實驗，尚不能說明AP-1在癲癇發病中作用，還需進一步研究。

綜上，AP-1高表達與癲癇發病間可能具有密切關系，進一步研究可能為癲癇發病機制研究提供一條新的途徑。

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