維生素E對約氏瘧原蟲感染BALB/c小鼠早期免疫應答的抑制效應

延 娟 劉 軍 李 瑩 潘艷艷 鄭 麗 曹雅明 (中國醫科大學基礎醫學院免疫學教研室，沈陽110001)

瘧疾是瘧原蟲通過媒介昆蟲蚊傳播的人類最嚴重的寄生原蟲感染性疾病。最新數據顯示，目前世界上有109個國家發生瘧疾流行，全球處于瘧疾風險的33億人群中，有2.7億人患瘧疾，其中將近100 萬人死亡［1］。

維生素E(Vitamin E，VE)是細胞內和細胞外的抗氧化劑，其在抗寄生蟲方面的作用多年來一直存有爭議。早在上一世紀，人們就已經發現VE與免疫系統之間存在某種聯系。有文獻報道給動物補飼高水平VE后，可增強T淋巴細胞的增殖，促進吞噬細胞的吞噬作用，同時提高細胞因子產生和抗體水平，從而有利于疾病的恢復［2］。同時也有研究顯示，VE可有效地增強新生兒的體液免疫應答，進而有效的抵抗新生兒期的感染［3］。

然而近年來，關于瘧疾和VE的研究發現，飲食中補充VE可加重C57小鼠的腦瘧癥狀;同時，在動物研究中發現，飲食中缺少VE可抵抗約氏瘧原蟲的感染。有文獻報道，感染瘧疾后紅細胞膜表面的維生素E濃度降低，從而造成紅細胞、瘧原蟲或者是瘧原蟲DNA的氧化破壞［4］;目前關于VE和瘧疾之間的相關免疫機制尚不清楚。為此，本研究利用我們成功建立的P.y17XL易感鼠瘧模型，動態地觀察了VE對P.y17XL易感小鼠免疫應答的影響，以期明確VE在P.y17XL感染早期的免疫調節作用及其相關機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物、瘧原蟲及主要試劑 6～8周齡、雌性BALB/c小鼠由中國醫學科學院實驗動物研究所提供(許可證編號：SCXK京200420001);P.y17XL(日本愛媛大學分子寄生蟲學教研室惠贈);PE-anti-CD69(clone H1.2F3BD Pharmigen)、FITC-anti-CD4(clone GK1.5，BD Pharmigen)、FITC-anti-CD11c(clone HL3，BD Pharmigen)、PE-anti-CD11b(clone M1/70，BD Pharmigen)、percp-anti-CD45R/B220(clone RA3-6B2，BD Pharmigen)、anti-TLR9(clone 5G5，hycultbiotech)和 PE-conjugated streptavidin(clone streptavidin，Biolegend)、FctⅢ/Ⅱ封閉抗體(clone 2.4G2，BD Pharmigen)、VE(sigma)。

無人機測繪技術一大優勢是可以搭載高清攝像設備進行高空遙感拍攝作業。首先，在工程測量過程中，運用無人機測繪技術對工程項目周圍的水文地質及地理情況等進行觀測，通過無人機高清攝像設備進行航拍，影像具有更高的清晰度，分析數據更加可靠，監測內容更加全面。其次，無人機測繪技術能將拍攝圖片放大，在遙感測量時，通過調控攝像軟件系統，能夠進行不同環境下的監測，從而使攝像過程中存在的誤差問題得到更好的控制。最后，無人機測繪技術在工程測量中，機動性明顯，搭載航拍設備或攝像系統能夠很好地實現高清攝像，還可以定時定位監測設置，優化了無人機測繪的整體效果充分發揮其在工程測繪中的優勢。

2.1兩組小鼠感染后不同時間的原蟲血癥水平和生存率 如圖1A所示，于感染后第2天，兩組小鼠外周血中均出現瘧原蟲感染的紅細胞。感染后第3天，原蟲血癥水平均為2% ～5%。隨后，與NC組小鼠相比，VE組小鼠原蟲血癥水平顯著升高，第6天時達到70%，同時如圖1B所示，在感染后第6天VE組小鼠的生存率只有30%，而NC組的生存率達到70%。CD11b+DCs，mDCs)的數量 如圖2A所示，與感染前相比，兩組小鼠pDCs的數量于感染后第3天開始升高，于感染后第5天達到最高水平，然而，VE組小鼠脾pDCs的數量在感染后一直低于NC組，兩者比較具有統計學差異(P＜0.05)。如圖2B所示，mDCs從感染后第3天開始升高，并于感染后第5天達到最高水平，且在感染后第5天，兩組之間具有統計學差異(P＜0.05)。

1.2實驗動物感染BALB/c小鼠分別經腹腔感染1×106P.y17XL寄生的紅細胞(pRBC)，感染不同時間小鼠經尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，鏡檢計數紅細胞感染率，并每日觀察生存率。

每份樣品用FITC-anti-CD4和PE-anti-CD69另設陰性對照管。預先加入FcγIIVII封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸液0.1 ml，再加入FITC-anti-CD4和PE-anti-CD69。離心去上清后，用0.5 ml細胞染色緩沖液重懸浮細胞，流式細胞儀進行檢測。

2.4兩組小鼠感染后不同時間巨噬細胞(F4/80+)的數量 如圖4所示，與感染前相比，NC組小鼠巨噬細胞數量從感染后3天開始升高，感染后第5天達到最高，而VE組小鼠巨噬細胞的數量和感染前相比，無明顯變化。且與NC組相比，感染后3天、5天，VE組明顯低于NC組(P＜0.05)。

通過對中老年糖尿病合并腦梗塞患者實施CT診斷后，取得顯著效果，部分患者伴有意識障礙、失語、肢體癱瘓等情況，患者自身血糖難以控制，其病情易反復發作，導致患者病情嚴重，高血糖患者自身腦水腫情況十分嚴重，應對患者飲食密切注意，嚴格對飲食中糖類攝入有效控制，才能顯著降低腦梗塞死亡性，通過控制患者血糖，對原發病實施積極治療，具有顯著效果，能改善中老年糖尿病合并腦梗塞患者的預后[4] 。

每份樣品用FITC-anti-F4/80另設陰性對照管。預先加入FcγIIVII封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸液0.1 ml，再加入FITC-anti-F4/80，離心去上清后，用0.5 ml細胞染色緩沖液重懸浮細胞流式細胞儀進行檢測。

每份樣品用FITC-anti-CD11c PE-anti-TLR9另設陰性對照管。預先加入FcγIIVII封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸液0.1 ml，再用FITC-anti-CD11c標記，固定透膜后再用biotinylated anti-TLR9和 PE-conjugated streptavidin標記細胞。離心去上清后，用0.5 ml細胞染色緩沖液重懸浮細胞，流式細胞儀進行檢測。

1.3動物分組與藥物處理 BALB/c小鼠隨機分為2組：大豆油處理組(NC組)和VE處理組，600 mg/kg(VE組)，每組20只小鼠，分別于感染前10天連續每天一次灌胃大豆油或VE 0.2 ml。

1.5統計學分析 使用SPSS17.0統計軟件對數據進行處理，標本采用獨立樣本t檢驗對數據做統計分析，P＜0.05具有統計學意義。

圖1 感染后不同時間原蟲血癥水平和生存率Fig．1 Parasitemia and survival rate of BALB/c mice in different time post infectionNote：A.Parasitemia;B.Survival rate.*.P＜0.05.

2.2兩組小鼠感染后不同時間脾臟 DCs亞群(CD11c+CD45R/B220+DCs，pDCs 和 CD11c+

2 結果

隨著人們生活水平的日益提高，人們對于精神生活也越來越重視。這時群眾文化活動就成了他們首要選擇的方式，其中群眾美術文化成為人們追捧的群眾文化活動之一。高水平的群眾美術輔導活動有利于提高群眾的審美能力。美術的發展經過了長時間的積累和進化，在傳承和發展的同時，美術用它自身的魅力，影響著一代又一代的人們。高水平的群眾美術活動可以豐富人們的生活，給人們帶來心靈上的凈化。

圖2 感染后不同時間脾臟DCs亞群的數量Fig．2 The percentage of the subsets of DCs in different time post infection

2.3兩組小鼠感染后不同時間脾臟CD11c+DCs細胞TLR9的表達水平 如圖3所示，與感染前相比，兩組小鼠TLR9的表達水平于感染后第3天、5天升高，然而，與NC組小鼠相比，VE組TLR9的表達無顯著差異。

2.5兩組小鼠感染后不同時間脾臟T細胞(CD4+CD69+T cells)的活化水平 如圖5所示，與感染前相比，兩組小鼠活化的T細胞的數量于感染后3天、5天均明顯升高，且在感染后第5天兩組之間具有顯著性差異(P＜0.05)。

圖3 感染后不同時間脾臟CD11c+DCs細胞TLR9的表達水平Fig．3 The percentage of CD11c+DCs expressing TLR9 in splenocytes in different time post infection

圖4 感染后不同時間脾臟巨噬細胞的數量Fig．4 The percentage of macrophages in different time post infection

1.4流式細胞儀檢測脾臟DCs亞群、巨噬細胞、TLR9的表達水平及T細胞的活化水平 無菌取出感染前(0天)和感染后第3、5天小鼠脾臟，常規方法制備脾細胞懸液，用0.17 mol/L NH4Cl裂解紅細胞。以含10%胎牛血清(FCS)的RPMI 1640調整脾細胞終濃度為1×107ml-1。每份樣品用FITC-anti-CD11c、PE-anti-CD11b、percp-anti-CD45R/B220另設陰性對照管。預先加入FcγIIVII封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸液0.1 ml，再加入 FITC-anti-CD11c、PE-anti-CD11b、percp-anti-CD45R/B220，離心去上清后，用0.5 ml細胞染色緩沖液重懸浮細胞，流式細胞儀進行檢測。

如今的世界工業已經進入第四次革命，德國“工業4.0”就是具體的表現，是對于“工業1.0”(機械化)、“工業2.0”(電氣化)、“工業3.0”(信息化)的延展。新經濟環境下制造業就是將智能化的新制造方式和具體的行業結合，實現個性化、定制化的設計、制作、物流平臺一條龍服務。我國的“制造2025”戰略中，也是將信息技術和制造技術深層次融匯，從要素驅動轉向創新驅動。由以往的能源損耗多、廢棄物產生多的粗糙模式變成綠色環保的模式，從低價模式變成性價比高模式，從生產模式變成服務模式。

近年來，血管瘤切除術在臨床中備受醫生和廣大患者的肯定和信賴，手術操作微創且痛苦少，恢復速度快，縮短患者住院時間[5] 。但手術治療是入侵式治療，會有一定風險，給予患者科學有效的護理指導，才能確保治療效果[6] 。

圖5 感染后不同時間脾臟T細胞(CD4+CD69+T cells)的活化水平Fig．5 The activation of CD4+CD69+T cells in different time post infection

3 討論

人體和動物模型研究結果均已表明：紅內期瘧原蟲和固有免疫細胞之間的早期相互作用對于抗瘧適應性免疫應答的建立至關重要［5，6］，因此，深入理解瘧疾免疫的調節機制無疑具有重要的科學意義。

不同遺傳背景的小鼠在感染同種瘧原蟲時，其免疫應答發生時相、強度明顯地影響著感染進程和最終結局。我們前期的研究結果已經表明，BALB/c感染P.yl7XL后不能有效地建立Th1免疫應答，紅內期瘧原蟲的爆發性增殖是BALB/c小鼠死亡的根本原因［7］。本實驗結果表明，VE補充后，雖然死亡率沒有明顯變化，但其感染率明顯高于對照組。由此提示VE補充后可進一步加重BALB/c小鼠的P.yl7XL感染。

目前，繼電保護裝置整機生產測試主要停留在手動測試或借助商用測試儀（如博電、昂立）和自主開發的測試儀進行的半自動測試階段。無論哪種測試方案，整個測試過程都過于依賴測試工程師的參與：測試工程師要不斷根據保護裝置的類型選擇測試線，并選擇相關功能進行測試。缺點是測試過程復雜，勞動強度較大，測試時間稍長。為此，本文深入研究智能電網保護裝置生產過程的各個子環節，通過對生產測試子過程的不斷集成及優化，生產過程大數據的綜合利用，整機測試儀的技術改進，氣動系統的靈活控制等，設計了繼電保護裝置整機智能測試系統，實現了繼電保護裝置的智能化大生產測試。

有關文獻報道，DCs明顯決定著瘧疾感染過程中Th應答的形式和效應強度［8］。本研究通過免疫調節劑VE對P.yl7XL易感小鼠BALB/c進行預先給藥處理，發現作為活化初始T細胞的唯一抗原提呈細胞，兩個重要細胞亞群活化均受到抑制，同時T細胞的活化也受到影響。

也有文獻表明，DCs成熟和效應功能持續發揮的重要前提是TLR對于病原相關分子模式(PAMPs)的識別。研究表明，TLR9可通過識別瘧色素誘導前炎癥細胞因子的產生，同時上調共刺激分子，進而誘導DCs的成熟和分化［9］。然而，在本實驗中補充 VE后兩組小鼠TLR9的表達無明顯差異。

除DCs外，大量研究表明，單核巨噬細胞明顯影響著瘧原蟲的感染進程。巨噬細胞既可作為非特異免疫細胞發揮非特異性吞噬、殺傷作用，也可參與介導特異性免疫應答，發揮抗原提呈和免疫調節的重要作用。我們前期的研究結果已經證實，活化的巨噬細胞在約氏瘧原蟲感染早期遏制瘧原蟲在紅內期的爆發性增殖，有效控制原蟲血癥的迅速上升［10］。然而在本實驗中發現，與對照組相比，在感染后5天，VE組小鼠巨噬細胞的數量明顯減少，且與感染前相比，補充VE后巨噬細胞的數量在感染后無有意義升高。由此提示，在瘧疾感染中，VE預處理可有效抑制巨噬細胞的活化，從而影響機體對瘧原蟲的殺傷。

綜上，VE作為一種免疫調節劑，在瘧疾感染的過程中可通過抑制固有免疫應答，進而加重瘧疾感染。

1 Feng H，Zhu X T，Qi Z M et al．Transient attenuated Foxp3 expression on CD4(+)T cells treated with 7D4 mAb contributes to the control of parasite burden in DBA/2 mice infected with lethal Plasmodium chabaudi chabaudi AS［J］.Scand J Immunol，2012;75(1)：46-53.

2 Puertollano M A，Puertollano E，de Cienfuegos G A et al.Dietary antioxidants：immunity and host defense［J］.Curr Top Med Chem，2011;11(14)：1752-1766.

3 Eggermont E.Recent advances in vitamin E metabolism and deficiency［J］.Eur J Pediatr，2006;165(7)：429-434.

4 Levander O A，Fontela R，Morris V C et al．Protection against murine cerebral malaria by dietary-induced oxidative stress［J］.J Parasitol，1995;81(1)：99-103.

5 Murray M J，Murray A B，Murray N J et al．Diet and cerebral malaria：the effect of famine and refeeding［J］.Am J Clin Nutr，1978;31(1)：57-61.

6 Taylor D W，Levander O A，Krishna V R et al．Vitamin E-deficient diets enriched with fish oil suppress lethal Plasmodium yoelii infections in athymic and scid/bg mice［J］.Infect Immun，1997;65(1)：197-202.

7 Wu Y，Wang Q H，Zheng L et al．Plasmodium yoelii：distinct CD4(+)CD25(+)regulatory T cell responses during the early stages of infection in susceptible and resistant mice［J］.Exp Parasitol，2007;115(3)：301-304.

8 Langhorne J，Albano F R，Hensmann M et al．Dendritic cells，proinflammatory responses，and antigen presentation in a rodent malaria infection［J］.Immunol Rev，2004;201：35-47.

9 Coban C，Ishii K J，Kawai T et al．Toll-like receptor 9 mediates innate immune activation by the malaria pigment hemozoin ［J］.J Exp Med，2005;201(1)：19-25.

10 潘艷艷，劉 軍，李 瑩et al．左旋精氨酸通過活化樹突狀細胞增強約氏瘧原蟲感染DBA/2小鼠的Th1應答效應［J］.中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2011;29(4)：247-251.