HLA-Ⅰ基因單核苷酸多態性與中國南方漢族女性乳腺癌易感性的相關性研究①

佟 琳 楊學習 李粉霞 孫敏英 劉民鋒 董建宇 郭昭澤 葉長生

(南方醫科大學南方醫院乳腺科，廣州510515)

目前，乳腺癌已成為女性最常見的惡性腫瘤。 2008年全球乳腺癌新增病例約138萬，占所有新發癌癥病例的22.9%(IARC：Cancer Epidemiology Database， GLOBOCAN.2008 ［http：//www-dep.iarc.fr］)。近幾年，雖然美國等西方發達國家的乳腺癌發病率和死亡率呈下降趨勢;但在中國卻逐年增長，2008年中國乳腺癌新發病例(16.9萬)比2002年(12.6萬)(IARC：Cancer Epidemiology Da-tabase，GLOBOCAN.2002 ［http：//www-dep.iarc.fr/］)增長了34%。

HLA是機體免疫識別，免疫應答及免疫調節的重要系統［1］。它決定機體的組織相容性，并以其多基因性和高度多態性成為人類的重要遺傳標記［2］。HLA基因定位于人類染色體6p21.3區域，可分為HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ、HLA-Ⅲ 3 個區域。目前已證明HLA參與腫瘤細胞逃避機體免疫監視過程，與多個系統性疾病存在相關性［2-4］。HLA-Ⅰ類分子廣泛分布于人體有核細胞表面，參與內源性抗原肽的加工、處理和提呈［5］。HLA-Ⅰ已被證實與多種腫瘤易感性相關［6-8］。HLA-Ⅰ類分子的表達降低、缺失是腫瘤細胞的一種逃逸方式，主要機制為針對HLA-Ⅰ類分子向T細胞遞呈的免疫原性多肽無法被識別，從而無法殺傷腫瘤細胞［9］。此外，HLA-Ⅰ還是預測乳腺癌復發、轉移風險的有效指標［10］，但HLA-Ⅰ基因單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism，SNP)與乳腺癌之間的關系尚不清晰。本文選取了HLA-Ⅰ基因編碼區的17個單核苷酸多態性位點，采用病例對照研究，通過 Sequenom MassArray?iPLEX GOLD系統，對中國南方漢族乳腺癌患者267例及健康對照組274例進行基因分型分析，探究其多態性與乳腺癌發病風險的相關性。

1 對象與方法

1.1研究對象 2009年5月12日到2010年7月2日，收集廣州南方醫院、廣州軍區總醫院、江西南昌大學第一附屬醫院、湛江廣東醫學院附屬第一醫院經病理學確診的乳腺癌患者血液標本267例，平均年齡為(47.8±9.28)歲，中位年齡為47歲。同期收集相應醫院體檢健康女性274人，要求無乳腺相關病史，無乳腺癌家族史和其它腫瘤病史，平均年齡(51±16.7)歲，中位年齡為49歲。所有對象均為中國南方漢族女性且相互間無血緣關系，獲得知情同意后，取外周血1～2 ml于酸性枸櫞酸葡萄糖抗凝管中，-80℃保存待用。

1.2方法

1.2.1DNA的提取 取外周靜脈血200 μl，用DNA提取試劑盒(北京天根生物技術有限公司，TIANamp Genomic DNA Kit)提取DNA(按說明書操作)，DNA保存于-70℃備用。

1.2.2引物的設計 根據HLA-Ⅰ編碼區域的目標序列和所選擇的多態性位點，利用Sequenom MassArray?Assay Design 3.1軟件設計多重PCR特異性擴增引物和單堿基延伸引物，其中針對各位點的PCR特異性擴增引物和單堿基延伸引物見表1。

表1 17個位點的PCR特異性擴增引物和單堿基延伸引物Tab．1 Specific PCR amplification primer and single base extension primer for 17 SNPs

1.2.3基因分型分析 采用 MassArray?-IPLEX SNP分型技術對所選樣本進行基因分型，步驟如下：將提取純化后的基因組DNA取1.0 μl，按順序加于特定的384孔板上，再添加PCR擴增體系使反應物的終濃度如下：0.1 U的Taq聚合酶，5 ng基因組DNA，各2.5 pmol的 PCR 引物，2.5 mmol的 dNTP。PCR反應條件為：95℃ 2分鐘;95℃ 20秒，56℃ 30秒，72℃ 60秒循環45次;72℃ 5分鐘;在上述體系中添加0.3 U的堿性磷酸酶，經37℃ 40分鐘，85℃5分鐘的反應去除剩余的dNTP;向體系中添加5.4 pmol的各延伸引物，50 μmol的 dNTP/ddNTP 混合物，0.5 U的Thermosequenase DNA聚合酶，反應條件為：94℃ 2分鐘;94℃ 5秒，50℃ 5秒，72℃ 5秒循環40次;72℃ 3分鐘。反應產物用樹脂脫鹽15分鐘后經自動點樣儀點樣于SpectroCHIP(Sequenom)芯片，點樣結束后的芯片用基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜(SpectroREADER，Sequenom)進行檢測。對DNA樣品進行質量控制，以保證基因分型成功率為95%以上。

1.2.4數據分析 對所選17個位點的基因型分布頻率進行Hardy-Weinberg平衡檢驗后，以在線分析工具http：//bioinfo.iconcologia.net/SNPStats和統計軟件SPSS13.0對數據進行病例-對照和受體狀態相關性的統計分析，再將病例組樣本按免疫組化結果中雌激素受體(Estrogen receptor，ER)、孕激素受體(Progesterone receptor，PR)、人類表皮生長因子受體2(Human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)狀態分為陽性組和陰性組。分析過程中采用共顯性(codominant)、顯性(dominant)、隱性(recessive)、超顯性(overdominant)四種遺傳模型。χ2檢驗分析不同分組的基因型頻率有無差異，非條件Logistic回歸計算比數比OR和95%可信區間(95%CI)，由此評估所選位點多態性與乳腺癌的相關性。檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

表2 不符合Hardy-Weinberg平衡的位點的基因型分布Tab．2 Distribution of SNPs inconsistent with the Hardy-Weinberg equilibrium

本研究所選位點在檢測樣本中均存在多態性，其中 7 個位點 rs2517749、rs1632902、rs4087726、rs9260475、rs9260489、rs9260571、rs9260619 不符合Hardy-Weinberg平衡(表2)，遂在隨后的統計分析析中不在包括在內。關聯分析發現，rs9260682與乳腺癌的發病風險和HER-2狀態存在相關性，rs9260682的AT基因型可增加攜帶者乳腺癌的患病風險(P=0.04)，且與HER-2陰性乳腺癌相關(P=0.04)。rs9260734雖與乳腺癌的發病風險不存在顯著相關性，但AA基因型與PR陰性乳腺癌相關(P=0.048)，具體結果見表4;其余8個位點rs9404952、 rs9295822、 rs6921314、 rs1632882、rs2517716、rs1632879、rs16896742、rs2571400 基因型分布在病例-對照、ER陽/陰性、PR陽/陰性、HER-2陽/陰性分組中均未顯示有明顯相關性(表3)。

表3 與乳腺癌患病風險無明顯關系的位點的基因型分布Tab．3 Distribution of insignificant SNPs in case-control studies

表4 rs9260682位點多態性與乳腺癌患病風險的相關性Tab．4 The association of rs9260682 polymorphisms and breast cancer risk

表5 rs9260734位點多態性與乳腺癌患病風險的相關性Tab．5 The association of rs9260734 polymorphisms and breast cancer risk

2.1 位點rs9260682多態性與乳腺癌及ER、PR和HER-2狀態的相關性分析 rs9260682在中國南方漢族女性存在AA、AT兩種多態性，在總體樣本中的分布頻率分別為96%、4%，在不同組別中的分別頻率如表4。該位點兩種基因型分布在病例-對照分組中有顯著統計學差異(P=0.04)，表明該位點多態性與乳腺癌易感性明顯相關;在ER陽/陰性、PR陽/陰性分組比較中發現，基因型分布雖有一定差異，但均無明顯統計學意義(P=0.76、P=0.50);HER-2分組比較結果顯示，該位點的多態性分布與乳腺癌HER-2狀態明顯相關(P=0.04)，攜帶雜合型AT者比純合型AA相比更傾向于HER-2陰性乳腺癌(OR=0.14，95%CI：0.02-1.23)。

2.2 位點rs9260734多態性分析與乳腺癌及ER、PR和HER-2狀態的相關性分析 rs9260734存在AA、GA、GG三種多態性，在總體研究樣本中的分布頻率分別12%、45%、43%。統計分析發現該位點基因型分布在病例-對照、ER陽/陰性和HER-2陽/陰性分組中均無統計學差異(表5);但在PR分組比較中發現rs9260734的多態性分布與PR狀態明顯相關(P=0.048)，AA基因型攜帶者更傾向于PR陰性乳腺癌(OR=0.44，95%CI：0.19-1.01)。

3 討論

乳腺癌的發病是多基因的作用結果，通過對乳腺癌易感基因的研究中已經發現，BRCA1和BRCA2是家族性乳腺癌的罪魁禍首。除了尋找易感基因，篩查易感性SNP位點也是乳腺癌基礎研究的一個熱點。作為第三代遺傳標記，SNP更適合作為生物標記在普通人群中進行檢測。全基因組關聯研究(Genome-wide association studies，GWAS)以大規模群體DNA樣本的SNP進行全基因組高密度遺傳變異檢測，并利用有效統計方法計算進行病例-對照分析，計算出基因分型變異頻率的差異，最終達到相關的變異與疾病的關聯分析，從而確定特定基因型的個體患病風險，實施個性化預防策略。目前通過GWAS關聯分析研究，已發現與乳腺發病相關的數十個基因，如 ABHD8、ANKRD16、CCND1、CDKN2A、CDKN2B、ECHDC1、ESR1、FGFR2、GLG1、GRIK1、KLF4、MAP3K1、MRPS30、TOX3 等的上百個 SNP 位點［11-26］，為了解乳腺癌發病的分子機制及易感因素提供了更多的線索。但GWAS研究也存在局限性，對已經發現的腫瘤易感位點需進行大樣本，多人群及相應的功能機制分析。

HLA與許多系統疾病，如運動系統、神經系統和感染性疾病等都存在相關性［6-8］，尤其是參與免疫調節及應答［27］。此外，HLA還參與腫瘤細胞逃逸免疫監視，在許多腫瘤的形成過程中發揮重要的作用，目前已有研究顯示HLA的多態性與腫瘤發生的易感性相關［6，28，29］。根據千人基因組計劃(http：//www.1000qenomes.orq/)，我們在 HLA-Ⅰ選取了17個SNP位點，探討HLA-Ⅰ基因多態性與乳腺癌的相關性，研究發現有7個位點不符合Hardy-Weinberg平衡。這與HLA基因多態性豐度極高有關，很多關于HLA及疾病的關聯研究會面臨所獲得的數據最終不符合Hardy-Weinberg平衡的問題［30］。

目前有較多證據顯示，HLA多態性與肝癌、白血病、卵巢癌、宮頸癌等多種癌癥易感性相關［7，8，31，32］。乳腺癌為女性最常見惡性腫瘤，HLA與乳腺癌發生發展密切相關。早在1990年就發現HLA在乳腺癌組織表達顯著低于癌旁組織［33］。轉移性乳腺癌組織HLA-Ⅰ的表達亦顯著下降［34］。此外，有研究顯示乳腺癌患者HLA-Ⅰ蛋白表達程度與腫瘤分級明顯相關［10，35，36］，且發現 HLA-Ⅰ表達越低淋巴結轉移越多及無病生存期越短(P＜0.05)［10］。Chardhuri［37］首先發現 HLA 區域 DQB3*02017/*0202等位基因與乳腺癌發病風險密切相關。David［38］在對墨西哥散發乳腺癌的研究中也發現HLAI基因上DRB1*1602和DQ*0301位點與乳腺癌的發病風險存在相關性，其他研究同樣顯示HLA-Ⅰ與乳腺癌明顯相關［39，40］，但這些數據主要以西方人群為基礎，目前尚無中國人群的相關報道。本研究在中國南方漢族女性中首次發現HLA-I基因上的rs9260682與乳腺癌患病風險顯著相關。我們實驗室已經報道該位點與鼻咽癌易感性同樣相關［41］，但目前尚無該位點與乳腺癌易感性的相關性研究。

ER、PR、HER-2為乳腺癌指導預后及臨床治療的重要指標，已成為臨床上常規檢查項目。ER、PR表達陽性的乳腺癌為激素敏感性患者，復發轉移風險低，預后較好，且適于內分泌治療。HER-2蛋白過表達與乳腺癌惡性程度呈正相關，是重要的預后指標，同時HER-2表達情況為臨床使用赫賽汀靶向治療提供依據。因此本研究聯合以上指標來分析HLA遺傳多態性與其狀態的相關性。結果顯示rs9260734與PR陰性相關，AA基因型攜帶者更傾向于PR陰性;rs9260682除與乳腺癌發病風險相關外，其AT基因型比AA基因型更傾向于HER-2陰性乳腺癌。

通過對HLA-I區域17個SNPs位點與乳腺癌易感性及受體狀態的相關性研究，發現rs9260682與中國南方漢族女性中乳腺癌易感性及HER-2陰性相關，rs9260734與乳腺癌PR陰性相關。該研究不僅有助于探討HLA-I在乳腺癌發生、發展中的作用，也可為乳腺癌的早期診斷和個體化醫療提供數據基礎。

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