結(jié)核分枝桿菌對異煙肼和利福平的耐藥水平與其耐藥基因突變的相關(guān)性研究

李桂蓮 張敬蕊 趙秀芹 楊驁 連璐璐 萬康林

INH和RFP是兩種最主要的一線抗結(jié)核藥之一，對這兩種藥物耐藥機制的研究日益受到重視。文獻(xiàn)報道Mtb對INH耐藥性的產(chǎn)生與過氧化氫酶－過氧化物酶編碼基因katG的缺失和突變及烯酰基還原酶編碼基因inh A 和oxy R－ahpC（oxy R，烷烴降解非必需基因，編碼過氧化物反應(yīng)調(diào)節(jié)子；ahp C編碼烷基過氧化氫還原酶）基因突變有關(guān)［1－5］。RFP耐藥性的產(chǎn)生與RNA聚合酶β亞基的編碼基因rpo B突變有關(guān)，文獻(xiàn)報道90%以上的RFP耐藥株在rpo B基因81個堿基的核心區(qū)域（編碼507－533位密碼子）－RFP耐藥決定區(qū)（rifampicin resistance－determining region，RRDR）發(fā)生突變［1，6－7］。

目前，關(guān)于Mtb基因突變的報道較多，而最低抑菌濃度（MIC）與突變位點之間的關(guān)系雖然早有研究，但由于檢測抗Mtb藥物的MIC對生物安全要求較高，國內(nèi)關(guān)于菌株對抗Mtb藥物的MIC與基因突變關(guān)系的研究報道較少，現(xiàn)將關(guān)于Mtb對INH的MIC與katG、inh A和oxy R－ahpC 突變及RFP的MIC與rpo B基因突變關(guān)系的研究報道如下。

材料和方法

一、菌株

Mtb標(biāo)準(zhǔn)株（H37Rv，ATCC27294）和75株經(jīng)菌種鑒定為Mtb的臨床分離株，包括13株同時耐INH和RFP（耐多藥菌株，指菌株至少同時對INH和RFP耐藥），1株同時耐INH、RFP、S和左氧氟沙星（耐多藥菌株），16株單耐 RFP，40株單耐INH，3株同時耐INH和S，1株同時耐INH和EMB，1株同時耐INH和左氧氟沙星的菌株，以上菌株均為本室保存。75株菌株中耐INH菌株共59株，耐RFP菌株共30株。對所有耐INH的菌株檢測INH MIC并PCR測序檢測katG、inh A和oxy R－ahp C基因的突變情況，對所有耐RFP的菌株檢測RFP MIC并PCR測序檢測rpoB基因的突變情況。

二、試劑和耗材

Middlebrook 7 H9干粉和牛血清蛋白－右旋糖苷－過氧化氫酶（ADC）營養(yǎng)添加劑購自美國BD公司；RFP、INH、S、EMB、左氧氟沙星、卷曲霉素、阿米卡星和Km等藥粉購自美國Sigma公司；Alamar blue試劑購自美國AbD Serotec公司；無菌96孔酶標(biāo)板購自美國Corning公司；PCR檢測試劑購自北京康為生物技術(shù)有限公司。

三、羅氏培養(yǎng)基比例法藥物敏感度實驗

按照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》［8］進(jìn)行，培養(yǎng)基中藥物終濃度如下：RFP 40μg/ml，INH 0.2μg/ml，S 4μg/ml，EMB 2μg/ml，卡那霉素30μg/ml，左氧氟沙星3μg/ml，卷曲霉素40μg/ml，阿米卡星30μg/ml［8－9］。

四、微孔板Alamar blue顯色法MIC測定

在磨菌管內(nèi)加入1～2滴5%吐溫－80（Tween－80），取2～3周Mtb新鮮培養(yǎng)物，加入4～5 ml生理鹽水并混勻；靜置5～10 min；取適量上清到25 ml培養(yǎng)瓶中，用生理鹽水調(diào)節(jié)濃度至1個麥?zhǔn)蠞舛龋话凑?0%的比例在7H9溶液中加入ADC；再取1個25 ml培養(yǎng)瓶，按1∶20比例用7 H9培養(yǎng)基稀釋4 ml菌液；在96孔板中每孔加入100μl 7 H9培養(yǎng)基，第1列再加入98μl培養(yǎng)基；第1列每孔加入2μl RFP（51.2 mg/ml）或INH（25.6 mg/ml）貯存液；按照2倍稀釋原則依次稀釋，至第11列，得到從256.0000～0.2500μg/ml或128.0000～0.1250μg/ml的藥液梯度，最后一列為空白；每株菌接種一行，每孔加入100μl稀釋菌液；另做一塊空白板（不含藥），每孔加入100μl 7H9培養(yǎng)基和100μl稀釋菌液，每株菌加4個孔；酶標(biāo)板第一行和最后一行加樣孔滴加生理鹽水以防干燥，用封口膜密封酶標(biāo)板；在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d；從第6天開始，在空白板中加入70μl顯色劑（Alamar blue∶5%Tween－80＝2∶5），隔天觀察變色情況。如顏色從藍(lán)色變成紫紅色或粉色，則在含藥培養(yǎng)基中加入顯色劑；若沒有變色或變色程度較淺，則繼續(xù)在另一對照孔中加入顯色劑，觀察至變色為止。在含藥培養(yǎng)基中加入顯色劑的第2天，觀察結(jié)果。對RFP MIC等于0.5000μg/ml和INH MIC等于0.2500μg/ml的菌株，進(jìn)行低濃度的藥物濃度梯度稀釋，RFP按1.0000～0.0010μg/ml的2倍系列稀釋；INH按0.5000～0.0005μg/ml的2倍系列稀釋。MIC定義為藍(lán)色完全沒有發(fā)生改變的最小藥物濃度。

五、Mtb基因組提取和PCR測序

Mtb基因組提取采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法［10］。利用直接測序法檢測RFP耐藥相關(guān)基因rpoB，INH耐藥相關(guān)基因katG、inh A和oxy R－ahpC，引物序列參考文獻(xiàn)［3，7，11］，PCR均采用50μl擴增體系，反應(yīng)條件均為：94℃變性5 min，然后94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物直接送到北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行單向測序，測序引物為PCR擴增用上游引物，測序儀器為ABI3730自動測序儀。采用生物信息學(xué)軟件DNASTAR Lasergene Editseq 7.1.0和GENtle 1.9.1對測序得到的基因序列與H37Rv基因序列進(jìn)行比對。

六、不同耐藥水平菌株基因突變率的比較

不同耐藥水平菌株基因突變率的比較采用四格表χ2檢驗或確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，采用統(tǒng)計學(xué)軟件包SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計。

結(jié) 果

一、耐藥 Mtb INH 的 MIC及katG、inh A 和oxy R－ahpC突變結(jié)果

59株對INH耐藥的Mtb其INH的MIC值及katG、inh A和oxy R－ahp C突變結(jié)果見表1。14株耐多藥和5株多耐藥（指菌株對2種或2種以上抗結(jié)核藥物耐藥但不包括耐多藥）菌株INH的MIC值分布在0.2500～2.0000μg/ml及大于128.0000μg/ml。40株單耐INH 菌株中 MIC分布在0.2500～32.0000μg/ml之間，以2.0000μg/ml為主，占全部單耐INH 菌株的67.5%（27/40）。59株INH耐藥菌株katG、inh A啟動子、oxy R－ahp C突變率分別為69.5%（41/59）、15.3%（9/59）、6.8%（4/59），總突變率為81.4%（48/59）。

INH MIC在0.2500～1.0000μg/ml的13株菌株，inh A 啟動子突變率為53.8% （7/13），katG 315突變率為15.4% （2/13）；MIC≥2.0000μg/ml的菌株inh A 突變率為4.3% （2/46），而katG 315突變率為76.1% （35/46）。INH 低水平耐藥菌株（MIC為0.2500～1.0000μg/ml）inh A 啟動子突變率高于高水平耐藥株（MIC≥2.0000μg/ml）（χ2＝15.57，P＝0.000）；而katG 315位突變率則相反（χ2＝13.48，P＝0.000），結(jié)果見表2。

二、耐藥Mtb菌株RFP MIC及rpo B基因突變結(jié)果

30株對RFP耐藥的Mtb其RFP MIC值及rpo B基因突變結(jié)果見表3。14株耐多藥菌株MIC值均在0.5000μg/ml及以上，16株單耐RFP菌株中除1株菌株 MIC為2.0000μg/ml，剩余15株MIC值在16.0000μg/ml及以上。30株菌株rpo B基因總突變率為96.7% （29/30），rpo B 531位突變率為70.0%（21/30），包括2種突變形式 TCG突變?yōu)?TTG（20株）、TTC（1株）；rpo B 526位突變率為16.7%（5/30），含3種突變形式 CAC突變?yōu)?CAG（1株）、TAC（1株）、GAC（3株）。其他rpo B 突變類型如516、522、堿基缺失各1株，1株菌株511和526位點形成聯(lián)合突變，1株菌株450、559和531位點形成聯(lián)合突變。

表1 對INH耐藥的Mtb菌株的INH MIC值及katG、inh A和oxy R－ahp C突變結(jié)果

表2 INH耐藥水平和katG 315、inh A啟動子突變的相關(guān)性分析結(jié)果

21株rpo B 531突變株 MIC分布在2.0000 μg/ml和＞256.0000μg/ml之間。5株rpo B 526突變株除了1株 MIC為0.5000μg/ml，其余4株MIC均在64.0000μg/ml及以上。RFP MIC在0.5000～16.0000μg/ml的菌株rpo B 531和526突變率為62.5%（5/8）；MIC≥32.0000μg/ml的菌株rpo B 531和526位點的總突變率為95.5%（21/22），分析發(fā)現(xiàn)RFP MIC≥32.0000μg/ml的菌株rpo B 531和526位點的突變率高于 MIC在0.5000～16.0000μg/ml的菌株，P確切概率＝0.048（表4）。

討 論

一、INH 耐藥水平與katG、inh A 和oxy R－ahp C突變的相關(guān)性

已知和INH耐藥有關(guān)的基因有katG、inh A、oxy R－ahp C、kas A 及ndh［1－5，12］。其中katG 和inh A是最主要的2個耐藥相關(guān)基因，報道稱katG和inh A突變分別占INH臨床耐藥株的50%～94%、10%～35%，以katG 315（AGC－ACC）（Ser－Thr）突變 率 最 高［1－2，13］。 而oxy R－ahpC突變率可達(dá)到10.0%～39.6%［3－4］。本研究59株INH 耐藥 Mtb的總突變率為81.3%（48/59），katG、inh A 啟動子、ox y R－ahpC 突變率分別為69.5%（41/59）、15.3%（9/59）、6.8%（4/59），總突變率為81.3%（48/59），這和文獻(xiàn)報道基本一致。

表3 對RFP耐藥的Mtb菌株的RFP MIC值及rpoB基因突變結(jié)果

表4 RFP耐藥水平和rpoB突變的相關(guān)性分析結(jié)果

文獻(xiàn)報道katG 315位突變與菌株對INH高度耐藥有關(guān)［2］。本研究發(fā)現(xiàn)INH低水平耐藥菌株（MIC為0.2500～1.0000μg/ml）以inh A 啟動子突變?yōu)橹?，高水平耐藥菌株（MIC≥2.0000μg/ml）以katG 315位 突 變 為 主。Abe等［14］將 96 株 經(jīng)BACTEC MGIT 960診斷為INH耐藥的菌株利用小川培養(yǎng)基比例法將這些菌株分為3個等級：低水平敏感（0.2μg/ml敏感），低水平耐藥（0.2μg/ml耐藥），高水平耐藥（1.0μg/ml耐藥），結(jié)果低水平敏菌株中只有inh A啟動子突變而無katG 315突變，低水平耐藥菌株inh A啟動子突變率（52.6%）高于katG 315突變率（15.8%），而61.7%的高水平耐藥菌株攜帶katG 315或katG缺失突變。Dalla Costa等［15］也發(fā)現(xiàn) MIC≥2μg/ml（刃天青顯色法）的菌株katG 315突變率更高。本研究和Abe等［14］及Dalla Costa等［15］的研究均證實了inh A啟動子突變與INH低耐藥水平有關(guān)，而katG 315突變與INH高水平耐藥有關(guān)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)6株MIC＞128.0000μg/ml的菌株有3株發(fā)生了oxy R－ahp C突變，提示oxy R－ahp C突變可能與INH高水平耐藥有關(guān)，但應(yīng)該增加樣本含量進(jìn)一步驗證。

本研究共4株 MIC在0.2500～1.0000μg/ml的INH耐藥株在katG基因315位點之外的位點發(fā)生突變，其中1株為katG 222 GCG－GAG（Ala－Glu）突變，1株katG 261 GAA－GAC（Glu－Asp）和inh A－15C－T聯(lián)合突變，2株katG 298 TTG－TGG（Leu－Trp）和inh A－15C－T聯(lián)合突變。由于其中有3株菌株與inh A－15C－T聯(lián)合突變，因此這4個katG基因突變位點和INH低水平耐藥的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。此外，1株 MIC為2.0000μg/ml的菌株為katG 315 和inh A－19 G－A 聯(lián) 合 突 變，inh A－19 和INH耐藥的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

二、RFP耐藥水平與rpo B突變的相關(guān)性

本研究共檢測了30株RFP耐藥株的rpoB基因突變情況，rpo B總突變率為96.7%，rpo B 531位突變率為 70.0% （21/30），rpoB 526位突變率為16.7%（5/30），和 文 獻(xiàn) 報 道 一 致［1，5，7，16］。RFP MIC≥32.0000μg/ml的菌株rpo B 531和526位點的突變率高于 MIC在0.5000～16.0000μg/ml的菌株。由此可見rpoB 531和526位基因突變和RFP高水平耐藥有關(guān)［17］。30株菌株中只有3株菌株發(fā)生rpoB 511和516位突變，文獻(xiàn)報道這2個位點和 RFP低水平耐藥有關(guān)［18］。Huitric等［17］發(fā)現(xiàn)rpo B基因RRDR區(qū)域除531和526之外還有多個位點與RFP高水平耐藥有關(guān)，只有522位點與RFP低水平耐藥有關(guān)（MIC 8～16μg/ml）。Hwang等［19］也發(fā)現(xiàn)在rpoB RRDR內(nèi)突變的菌株其 MIC比在RRDR外發(fā)生突變的菌株高。本研究未發(fā)現(xiàn)rpoB 533位基因突變的菌株，但有研究表明該位點與RFP低水平耐藥有關(guān)［18］。

另外，還有16.9%的INH耐藥株和3.3%的RFP耐藥株沒有發(fā)現(xiàn)突變，這可能和本研究所測基因測序范圍外的其他突變位點或是與其他耐藥相關(guān)基因突變有關(guān)，如RFP耐藥相關(guān)的rpo B基因的氨基端和羧基端［7，20］、INH 耐藥相關(guān)的ndh［12］等。此外，最近研究還發(fā)現(xiàn)INH和RFP的耐藥還與Mtb藥物外排泵基因Rv1410c和Rv0783的高表達(dá)有關(guān)［21］。

由于本研究耐多藥菌株只有14株，因此分析基因突變與耐藥水平相關(guān)性時未將兩者結(jié)果分開。但發(fā)現(xiàn)耐多藥或多耐藥菌株與單耐INH或單耐RFP菌株相比，基因突變類型較多，如INH耐藥株中，前者為8種突變類型而后者僅為4種突變類型；在RFP耐藥株中，前者為6種突變類型而后者僅為4種突變類型。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Mtb katG 315位突變和INH高水平耐藥有關(guān)，inh A啟動子突變與INH低水平耐藥有關(guān)，oxy R－ahp C間隔區(qū)基因突變可能與INH高水平耐藥有關(guān)，但應(yīng)增加樣本含量進(jìn)一步驗證；rpoB 531和526位點突變與RFP高水平耐藥有關(guān)。本研究所得數(shù)據(jù)以及一些新的發(fā)現(xiàn)，為進(jìn)一步研究Mtb對INH和RFP的耐藥機制提供了理論依據(jù)，對于結(jié)核病的治療和控制將起重要作用。

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