人細胞角蛋白19片段單克隆抗體的制備和鑒定

劉紅，劉賓，李瑞娟，楊萌萌，李鵬聰，張鑫，孫旭東，楊鐵生

細胞角蛋白（cytokeratin，CYK）是形成上皮細胞骨架的主要結構蛋白，具有保持上皮細胞完整性的作用[1]。根據等電點和分子量不同，CYK 可以分為 I 型和 II 型，I 型 CYK 屬于酸性蛋白，包括 CYK-9 ～ CYK-23，II 型 CYK 屬于堿性蛋白，包括 CYK-1 ～ CYK-8[2]。I 型 CYK 中的 CYK-19廣泛分布在正常組織表面的層狀或鱗狀上皮細胞，分子量約為 40 kD[3]。

CYFRA21-1 是 CYK-19 被半胱天冬酶 3 裂解后，從細胞中釋放出來時形成的可溶性片段[4]，在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）、頭頸鱗細胞癌、口腔鱗狀上皮細胞癌等鱗細胞癌中，或者乳腺癌、肝癌、肺癌和胰腺內分泌腫瘤等轉移癌類中都會高表達[5-9]，具有很好的血清診斷學價值，已被作為腫瘤細胞在血液和骨髓中循環的標志物，同時也是預后診斷的重要標志物[10-11]。目前，臨床上應用的人血清 CYFRA21-1 免疫檢測試劑盒中的抗體主要為進口產品，而具有高結合能力的特異抗體的制備是免疫檢測方法成功建立的關鍵[12]，也是影響檢測成本的重要因素。因此，CYFRA21-1特異 mAb 單克隆抗體的制備，對免疫檢測方法的建立和檢測成本的控制具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清樣本 血清樣本共計 134 份，其中男性 74 份，女性 60 份，年齡在 20 ～ 92 歲，全部為本院門診及住院患者樣本。

1.1.2 實驗動物 6 周齡，雌性 BALB/c 小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.1.3 主要試劑和儀器 CYFRA21-1 化學發光法定量檢測試劑盒為北京源德生物醫學工程有限公司產品；CYFRA21-1 重組蛋白購于德國 Progen公司；堿性磷酸酶標記的山羊抗鼠和辣根過氧物酶標記的山羊抗鼠 IgG 購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司；BCIP/NBT 底物顯色試劑盒、可溶性單組分 TMB 顯色試劑盒購于北京天根生物技術有限公司；蛋白預染和普通 Marker 均購于北京全式金生物技術有限公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺購于 Genview 公司（北京）；0.45 μm PVDF 膜購于北京華美轉導科技有限公司；完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、抗 Ig 亞型分析試劑盒（ISO1 型）購自 Sigma 公司；HAT、100 × HT、PEG 4000、RPMI-1640、IMDM 購于美國 Gibco 公司；HItrap Protein G 購自美國 Parmacia Biotech 公司；其他試劑均為國產分析純；小鼠骨髓瘤細胞（SP2/0）為本實驗室保存。

MPC-1 型微孔單光子計數儀為北京源德生物醫學工程有限公司產品；蛋白電泳儀、半干轉膜儀、680 型酶標儀為美國 Bio-Rad 產品；5417R 型高速冷凍離心機為德國 Eppendorf 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 間接 ELISA CYFRA21-1 蛋白溶于0.05 mol/L pH 9.6 的 Na2CO3包被液，終濃度5 μg/ml，100 μl/孔包被微孔板，4 ℃ 過夜；棄去包被液，每孔加入含有 1% 酪蛋白的 0.02 mol/L 的PBS（pH 7.4）封閉液 300 μl，2 ～ 8 ℃ 封閉 12 ～18 h；棄去封閉液，用 0.02 mol/L PBST 洗板 3 次，拍干，常溫抽干 12 ～ 18 h 后，置于密封袋中，2 ～8 ℃ 保存；直接或者用 PBST 將待測樣品（血清、腹水或者細胞上清）稀釋后，每孔 100 μl，37 ℃ 溫育 1.5 h，PBST 洗板 5 次，拍干；用 PBST 將 HRP標記的山羊抗屬 IgG 按 1:5000 倍稀釋，100 μl/孔，37 ℃ 溫育 1 h，PBST 洗板 5 次，拍干；TMB 顯色，20 min 后，用 2 mol/L 的硫酸 50 μl/孔終止顯色反應，450 nm 下測定各孔 OD 值。1.2.2 抗體制備

1.2.2.1 小鼠免疫 8 只 BLAB/c 小鼠，進行尾部采血，收集血清分別用間接 ELISA 測定小鼠血清的免疫前效價；將 CYFRA21-1 用等體積的弗氏完全佐劑混勻充分乳化，50 μg/只，背部皮下多點注射小鼠，進行初免；每間隔 3 周進行 1 次加強免疫，共計 2 次，每次 CYFRA21-1 都與等體積弗氏不完全佐劑混勻乳化，免疫量為 25 μg/只，免疫方法為背部皮下多點注射；間隔 10 d 后，對 8 只小鼠分別進行尾部采血，收集血清，通過間接ELISA 測定免疫后小鼠血清效價。

1.2.2.2 細胞融合 選取 3 次免疫后血清效價最高的小鼠，將 CYFRA21-1 溶于 PBS，按50 μg/只進行脾臟終加強免疫；3 d 后脫頸殺死加強免疫的小鼠，無菌取脾，收集脾淋巴細胞，與 SP2/0細胞在 PEG 4000 作用下進行融合；用含 1% HAT的完全 RPMI-1640 培養液進行培養篩選，于融合后的第 3、6 天進行換液處理；融合后第 7 ～ 14 天改用 HT 培養液，第 14 天后采用完全培養液；融合后第 8 天采用有限稀釋法對陽性克隆進行連續篩選，待細胞集落生長至孔底 1/3 時，吸取上清用間接 ELISA 方法篩選，陽性克隆率達到 100%時，正式建株；用 ISO1 鼠 mAb 亞類檢測試劑盒，按照說明書，檢測制備雜交瘤細胞分泌抗體的亞型；對陽性雜交瘤細胞進行擴大培養，并液氮冷凍保存。

1.2.2.3 腹水 mAb 的制備及純化 6 周齡雌性BALB/c 小鼠，每只腹腔注射 0.5 ml 滅菌石蠟油，每株抗體準備 2 只小鼠；7 d 后取生長良好雜交瘤細胞重懸于無血清培養基中，每只小鼠腹腔接種1 × 106個細胞；7 ～ 14 d 后，小鼠腹腔明顯增大時，采集腹水；采用飽和硫酸銨法，利用 protein G 親和柱，純化效價較高的腹水；0.02 mol/L 的 PBS（pH 7.4）對洗脫液進行透析，將純化好的抗體保存在PBS 中，SDS-PAGE 檢測 mAb 純度；Bradford 法測定 mAb 濃度。

1.2.3 mAb 的特性鑒定

1.2.3.1 mAb 效價測定 用已建立間接 ELISA方法測定制備的 mAb 效價。

1.2.3.2 Western blot 將 CYFRA21-1 重組蛋白溶于 0.02 mol/L 的 PBS（pH 7.4）中，制備 12% 的濃縮膠和 5% 分離膠，按 15 μg/孔上樣，進行SDS-PAGE；分離濃縮膠和分離膠，15 V 電壓下，電轉 40 min，將分離膠上蛋白轉移到 PVDF 膜；PVDF 膜浸泡在含 0.1% Tween-20 和 5% BSA 的20 mmol/L TBS 緩沖液（pH 7.4）中，4 ℃ 封閉過夜；用含 0.1% Tween-20 的 TBS 緩沖液（pH 7.4）洗膜，每次 10 min，共 4 次；用含 1% BSA 和0.1% Tween-20 的 TBS 緩沖液將純化好的 mAb分別稀釋 10 000 倍，室溫浸泡 PVDF 膜 2 h 后，重復洗膜過程；用含 1% BSA 的 TBS-T 緩沖液將堿性磷酸酶標記的山羊抗鼠稀釋 5000 倍作為二抗，室溫浸泡 PVDF 膜 2 h 后，重復洗膜過程；加入顯色底物，顯色 5 min 后，用蒸餾水終止反應。

1.2.3.3 競爭 ELISA CYFRA21-1 蛋白溶于0.05 mol/L pH 9.6 的 Na2CO3包被液，終濃度50 μg/ml，100 μl/孔包被微孔板，4 ℃ 過夜；棄去包被液，每孔加入含有 1% 酪蛋白的 0.02 mol/L的 PBS（pH 7.4）封閉液 300 μl，2 ～ 8 ℃ 封閉 12 ～18 h；棄去封閉液，用 0.02 mol/L PBST 洗板 3 次，拍干，常溫抽干 12 ～ 18 h 后，置于密封袋中，2 ～8 ℃ 保存；用 PBST 將待制備的 CYFRA21-1 單抗稀釋至終濃度 3 μg/ml，取 50 μl 待測校準品或血清樣品與 50 μl 稀釋好的 mAb 共同加入 96 孔板，充分混勻，37 ℃ 溫育 0.5 h，PBST 洗板 5 次，拍干；用 PBST 將 HRP 標記的山羊抗鼠 IgG 按1:5000 倍稀釋，100 μl/孔，37 ℃ 溫育 1 h，PBST洗板 5 次，拍干；TMB 顯色，20 min 后，用 2 mol/L的硫酸 5 μl/孔終止顯色反應，450 nm 下測定各孔OD 值，計算樣品濃度值。

1.2.3.4 人血清 CYFRA21-1 檢測 嚴格按照北京源德生物醫學工程有限公司的 CYFRA21-1 化學發光檢測試劑盒操作說明書進行。

2 結果

2.1 小鼠血清效價

如圖 1 所示，將經過 3 次免疫之后，8 只小鼠血清效價都有了明顯提高；以 P/N（陽性孔吸光值/陰性對照孔吸光值）≥ 2.1 為判斷是否具有免疫活性的標準，1 號小鼠血清稀釋 64 × 103倍，2 號小鼠血清稀釋 128 × 103倍，3 號稀釋 16 × 103倍，4、5 和 6 號血清稀釋 512 × 103倍，7 和 8 號稀釋 256 × 103倍后仍具有免疫活性；其中，4 號小鼠在 3 只血清免疫活性最高的小鼠中，在相同稀釋倍數下，其 OD450吸光值最高，因此選取 4 號小鼠進行雜交瘤細胞建株。

2.2 雜交瘤細胞株的建立

將雜交瘤細胞株上清從 1:2000 開始進行倍比稀釋，用間接 ELISA 方法檢測，以 P/N（陽性孔吸光值/陰性對照孔吸光值）≥ 2.1 為判斷是否為陽性細胞株的判斷標準，共有 5 株雜交瘤細胞能持續穩定分泌 CYFRA21-1 的 mAb，其中 3F1、2G8、12G7 和 4H12 上清稀釋 2048 × 103倍，1D10 上清稀釋 1024 × 103倍后，都仍具有免疫活性（表 1）。經抗體亞型檢測試劑盒檢測，上清效價較高的 3F1、2G8、12G7 和 4H12 4 株雜交瘤細胞中，2G8、12G7 兩株細胞系分泌抗體都為IgG1，輕鏈都為 κ，將這兩株細胞分泌抗體分別命名為 2G8 和 12G7。

2.3 mAb 純化和效價

圖 1 小鼠血清效價Figure 1 The titers of mice sera

表 1 陽性雜交瘤細胞Table 1 The positive hybridoma cell

圖 2 mAb 純化Figure 2 Purification of mAb

如圖 2 所示，SDS-PAGE 檢測純化后的 2G8和 12G7 兩株抗體純度都高于 95%，重鏈分子量約為 50 kD，輕鏈分子量約為 27 kD，符合理論分子量；經 Bradford 法檢測，2G8 濃度為 1.2 mg/ml，12G7 濃度為 2.0 mg/ml。

用建立的間接 ELISA 方法檢測，以 P/N（陽性孔吸光值/陰性對照孔吸光值）≥ 2.1 為判斷陽性的標準，2G8 在稀釋 1024 × 103倍時仍具有免疫活性，12G7 在稀釋 2048 × 103倍時仍具有免疫活性，效價分別為 1 × 10-6和 5 × 10-7（圖 3）。

2.4 mAb 特異性

Western blot 結果表明（圖 4），2G8 和 12G7都能準確識別 CYFRA21-1 蛋白，產生一條分子量稍大于 30 kD 的條帶，符合理論分子量大小。

圖 4 Western blot分析結果Figure 4 Analysis result of western blot

人絨毛促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）、人促卵泡激素（follicle stimulating hormone，FSH）和人促黃體生成素（luteotropic hormone，LH）是存在于血清中的CYFRA21-1 主要類似物，用含有 1% 酪蛋白、5‰Proclin-300 的 0.01 mol/L PBS（pH 7.4）作為稀釋液，經競爭 ELISA 檢測顯示，2G8 和 12G7 與這3 種類似物交叉反應率最高只有 0.77%（表 2），表明 2G8 和 12G7 具有很高的特異性，能特異識別 CYFRA21-1，而不會與血清中其他類似物產生明顯交叉反應。

2.5 人血清 CYFRA21-1 檢測

圖 3 2G8 和 12G7 效價Figure 3 The titers of 2G8 and 12G7

表 2 與類似物的交叉反應率Table 2 Cross reactivity (CR) with analogues

圖 5 相關性分析Figure 5 The correlation analysis

用利用 2G8 和 12G7 建立的競爭 ELISA 檢測方法，對來自本院的 134 份血清樣本進行檢測，將其結果與北京源德生物醫學工程有限公司的CLIA 檢測試劑盒檢測結果分別比較發現，檢測結果之間沒有顯著差異（F = 0.0908 ＜ F臨界值= 3.0183，P = 0.9132 ＞ 0.05），線性關系分別為 y = 0.8167 x +0.3755（r = 0.9772）（圖 5A）和 y = 0.8142 x +0.3655（r = 0.9770)（圖 5B）。

3 討論

癌癥已經成為危害人類健康的首要疾病之一，但如果能準確診斷，并在預后對病情發展進行有效監控，能顯著改善患者的生活質量，并延長患者壽命。CYFRA21-1 是 CYK-19 的可溶性片段，存在于肺癌、食管癌等上皮細胞起源的腫瘤細胞中，能被釋放進入血液，是 NSCLC 的最敏感腫瘤標志物，并且與癌變程度有關，已被作為多種腫瘤診斷和預后監測標志物[10]。目前，CYFR21-1 的臨床檢測方法基本都是基于免疫檢測平臺，因此其特異mAb 的制備具有重要的實際應用價值。

1992 年，Pujol 等[4]就采用雜交瘤技術，制備出 BM19.21 和 KS19.1 兩株 mAb，并被配對使用建立了 CYFRA21-1 的免疫測定方法，能夠特異識別血清中的 CYFRA21-1。至今，臨床上已有多種細胞角蛋白的特異 mAb 被應用到細胞角蛋白可溶性片段的免疫檢測上[13]。國內有多種CYFRA21-1 免疫檢測試劑盒被商品化，但所用抗體都為國外進口產品，增加了試劑盒成本。本研究通過雜交瘤技術，制備出了 2G8 和 12G7 兩株CYFRA2 的 mAb，都屬于輕鏈為 κ 的 IgG1，效價分別為 1 × 10-6和 5 × 10-7，能從血清樣本中特異識別 CYFRA21-1，并且經 protein G 純化后，純度都高于 95%，濃度也分別達到 1.2 mg/ml 和2.0 mg/ml，利用這兩種 mAb 通過競爭 ELISA 對134 份血清樣本的檢測結果與北京源德生物醫學工程有限公司的 CYFRA21-1 化學發光定量檢測試劑盒的檢測結果有很好的相關性，表明這兩種mAb 能代替進口 CYFRA21-1，用于 CYFRA21-1免疫診斷試劑盒完全國產化，及其生物學特性的深入研究。

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