純化標簽不同融合端的選擇對蝎毒肽色譜行為的影響

惠長野，邵建華，郭妍，張希，楊學琴，王佃鵬

蝎尾腺分泌的蝎毒具有極大的醫學價值，蝎毒的主要活性成分是一類由 28 ～ 76 個氨基酸殘基組成的小分子多肽。按其分子的大小，可分為長鏈和短鏈兩大類。蝎毒素雖然空間結構簡單，生理活性卻具有多樣性，因而一直是研究的熱點[1-2]。本實驗以東亞鉗蝎抗癲癇肽（anti-epilepsy peptide，AEP，GI:37999913）為模型，在實現 rAEP 原核可溶表達的基礎上，結合肽鏈構象預測 His tag 在重組肽不同末端融合時的空間屏蔽效應，并構建相應的表達載體進行驗證。為類似活性多肽的重組表達提供借鑒，以滿足這類具有藥用潛質的多肽的開發需求。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 表達載體及試劑 大腸桿菌 BL21（DE3）為本室保存；非融合表達質粒 pTrx 為沈陽藥科大學生化教研室構建[3]；Pyrobest DNA 聚合酶、限制性內切酶 Nco I、EcoR I 及 T4 DNA 連接酶為日本 TaKaRa 公司產品；引物均由上海生工生物工程公司合成；LB 培養基成分購自英國 Oxoid 公司；金屬離子螯合柱 HisTrap FF為瑞典 Amersham 公司產品。

1.1.2 實驗動物 昆明種小白鼠（SPF 級），雄性，體重 20 ～ 25 g，購自沈陽藥科大學實驗動物中心，合格證號：遼實合字 033 號。實驗前，以顆粒狀基礎飼料飼喂 1 周以適應環境。

1.2 方法

1.2.1 AEP 生物信息學分析 Genbank 中搜索AEP 成熟肽同源序列并進行比對分析，根據 PDB庫中收錄的同源序列空間結構，用 WHAT-IF 軟件對 AEP 進行建模。

1.2.2 pTrx-His-AEP 及 pTrx-AEP-His 表達載體的構建 以東亞鉗蝎尾腺 cDNA 庫為模板，根據Genbank 中 AEP 成熟肽序列設計引物見表 1。上游引物 P1 中，下劃線為 Nco I 酶切位點，6 個組氨酸編碼序列加粗顯示，下游引物 P2 帶有 EcoR I位點及終止密碼子，PCR 產物經 Nco I 及 EcoR I雙酶切，插入經過同樣雙酶切的 pTrx 中構建成純化標簽 N端融合的表達載體 pTrx-His-AEP，編碼重組肽為 Met-Gly-His6-AEP，重組質粒轉錄翻譯區見圖 1。純化標簽 C 端融合的表達載體 pTrx-AEPHis 構建方法同上，下游引物 P4 中引入 6 個組氨酸的編碼序列，編碼重組肽為 AEP-His6。

1.2.3 rAEP 的表達、純化 攜帶有重組質粒的BL21（DE3）接種至含卡那霉素 40 μg/ml 的 LB液體培養基中，37 ℃ 培養至 OD600= 0.6，加入終濃度為 0.4 mmol/L 的 IPTG 誘導培養 4 h 后，離心收集菌體，超聲破碎后的上清液上樣至用起始緩沖液平衡好的 HisTrap FF 柱。非變性條件下純化選用降低 pH 結合 NH4Cl 競爭洗脫，同時考察8 mol/L 尿素變性條件下的洗脫情況。

表 1 AEP 擴增用引物Table 1 Primers used in this study

圖 1 重組質粒克隆/表達區Figure 1 pTrx-AEP cloning/expression region

1.2.4 rAEP 生物活性測定 采用硫代氨基脲致小鼠神經興奮模型[4]。取體重 20 ～ 25 g 雄性昆明種小鼠 40 只，隨機分為 4 組，按 2.0 mg/kg皮下注射 rAEP，以等容生理鹽水為陰性對照、4.0 mg/kg 苯巴比妥鈉為陽性對照，于給藥 20 min后，腹腔注射硫代氨基脲 11.0 mg/kg，記錄 120 min內試驗動物奔跑型轉至強直型驚厥發作潛伏時間，以相對陰性對照組的驚厥發作潛伏時間延長率為活性指標。

2 結果

2.1 AEP 序列分析及同源建模

AEP 與蝎毒素中昆蟲抑制性神經毒素的同源性最高（圖 2）。Cys3 與 Cys6、Cys4 與 Cys7、Cys1 與 Cys8、Cys2 與 Cys5 配對成 4 個二硫鍵，在此基礎上形成一個保守的結構域（knottin fold），該結構對這類肽的生物活性和熱穩定性都十分重要[5]。

AEP 建模的平面截圖見圖 3。AEP 空間結構與大部分長鏈蝎神經毒素相似，由一段 α 螺旋和三段反向平行的 β 片層構成一個緊密的疏水核心，而 C 端為無規則卷曲，肽鏈相對比較延伸。

圖 2 AEP 與抑制性昆蟲毒素的序列比對分析Figure 2 Amino acid sequence comparison of AEP and depressant insect toxins

圖 3 AEP 的空間結構及二硫鍵配對（紅色：α 螺旋；藍色：β 片層；綠色：β 轉角；黃色：二硫鍵）Figure 3 Three-dimension structure and disulfide bonds of AEP (Red: helix; Blue: beta strand; Green: bend; Yellow: disulfide bond)

2.2 pTrx-His-AEP 及 pTrx-AEP-His 表達載體的構建

從空間結構可以看出，AEP 的 N 端依次為βαββ 形成了一個緊密結構（knottin fold），His tag融合于 N 端，容易被疏水核心所屏蔽。而 C 端肽鏈延伸出來，His tag 置于 C 端利于其與鎳離子結合。為此我們構建了 His tag 不同末端融合的表達載體，重組質粒經雙酶切后，在 250 bp 處出現目的條帶（圖 4A），測序分析顯示與預期相符。His tag體積小，并不影響 rAEP 的表達，不同末端融合的情況下，TrxA 和 rAEP 都得到高效可溶性表達，表達量相近（圖 4B）。

圖 4 重組質粒 pTrx-AEP 的構建Figure 4 Construction of recombinant plasmid pTrx-AEP

2.3 Met-Gly-His6-AEP 與 AEP-His6 純化結果對比

離心富集誘導后菌體，起始緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）重懸，超聲破碎后，高速離心（17800 × g，30 min，4 ℃）取上清。上樣至起始緩沖液平衡好的 HisTrap FF，再平衡至基線穩定。改變 pH 洗脫，隨著 pH 的降低，His tag 與金屬離子螯合柱的結合能力降低，溶液洗脫能力增強。每次換用不同 pH 值溶液時，清洗至基線穩定，且流出液 pH 恒定。pH 6.0 ～ 7.0 采用 25 mmol/L PBS 作為緩沖體系，pH 4.0 ～ 5.0 采用 25 mmol/L NaAc-HAc 緩沖體系。變性條件下的洗脫，為在各溶液體系中引入 8 mol/L 尿素。

2.3.1 Met-Gly-His6-AEP 純化結果 非變性條件下，各 pH 值緩沖液洗脫組分電泳分析結果見圖 5A。降低 pH 減弱 rAEP 與 HisTrap FF 的結合力，rAEP 電泳條帶在 6.5 kD 附近，少有菌體蛋白干擾。可見 rAEP 在各洗脫峰中都存在，很難得到電泳純樣品。隨后洗脫液中引入了強變性劑8 mol/L 尿素，高濃度尿素的加入不破壞二硫鍵，但可以解除次級鍵對肽鏈構象的約束，使肽鏈得到充分延伸，利于 His tag 的暴露。實驗結果（圖 5B）也證實了這點，rAEP 與填料結合力增強，含有0.4 mol/L NH4Cl 的 pH 4.0 緩沖液洗脫峰達到了電泳純，但清洗除雜步驟還是伴隨有 rAEP 的損失，最終每升發酵液經純化后獲得純度大于 95%樣品約為 0.8 mg。

圖 5 Met-Gly-His6-AEP 純化過程中收集組份的 17.5%Tris-Tricine SDS-PAGE 分析Figure 5 17.5% Tris-Tricine SDS-PAGE for purification of Met-Gly-His6-AEP

2.3.2 AEP-His6純化結果 根據空間結構推測His tag C 端融合有利于其更好地暴露，實驗結果很好地證明了這點，非變性條件下圖 6A，rAEP 在pH 降為 4.0 時都沒被洗脫，隨后加入 0.2 mol/L NH4Cl 才被洗脫，但純度不高。圖 6B 為 8 mol/L尿素存在下的洗脫結果，變性條件下 His tag 暴露更加充分，利于用更苛刻的條件除雜質，0.4 mol/L NH4Cl 洗脫峰達到了電泳純。更重要的是洗滌步驟幾乎沒有 rAEP 的損失，每升發酵液經純化后獲得純度大于 95% 樣品量提高為 3.3 mg。

圖 6 AEP-His6 純化過程中收集組份的 17.5% Tris-Tricine SDS-PAGE 分析Figure 6 17.5% Tris-Tricine SDS-PAGE for purification of AEP-His6

2.4 Met-Gly-His6-AEP 與 AEP-His6 抗小鼠神經興奮活性

在硫代氨基脲致小鼠神經興奮模型中，兩者均表現出抗神經興奮作用（圖 7）。AEP-His6使小鼠驚厥大發作潛伏時間延長 47.7%，顯著高于 Met-Gly-His6-AEP 組（26.6%）及陽性對照藥苯巴比妥鈉組（28.4%）。推測與肽鏈 C 端延伸出 knottin fold 結構域，His tag 對活性中心構象影響小有關。

圖 7 rAEP 抗小鼠神經興奮活性[結果以驚厥發作潛伏時間延長率±s 表示，AEP-His6 組延長率顯著高于 Met-Gly-His6-AEP 及苯巴比妥鈉組（*P ＜ 0.01）]Figure 7 Anti-neuroexcitatory activity of rAEP in mouse model. [The error bars represent the standard deviation of the mean, *P ＜ 0.01 by unpaired t test, significantly different from phenobarbital group. There was no statistically significant difference between Met-Gly-His6-AEP and phenobarbital groups (P ＞ 0.05)]

3 討論

AEP 與蝎昆蟲抑制性神經毒素高度同源，它們都作用于 Na+通道，是 Na+通道抑制劑。這類長鏈蝎毒素大多由一個螺旋（極少數是兩個螺旋）、兩段或三段反向平行的 β 折疊組成一個緊密的結構核心，二硫鍵對核心結構起著加固作用，親水殘基的側鏈暴露在溶液中，是分子具有不同特異性的結構基礎[5-6]。

在過量共表達硫氧還蛋白 TrxA 的情況下，營造胞質內氧化態勢利于二硫鍵的形成，AEP 這類富含二硫鍵的活性肽得到了可溶性表達[3,7]。蝎毒肽具有分子量小、結構簡單及生物活性強的特點，這些毒素分子正在成為新藥開發及設計的模板。肽鏈末端極短肽段的去除對生物活性影響都很顯著，額外加入的肽段對空間結構及活性中心結構域的形成影響顯著[8]。重組表達時不宜選擇過大的融合標簽，His tag 被廣泛用作小分子活性肽的親合標簽。結合分子構象，考慮 His tag 融合端的選擇對后序純化及生物活性的影響，對各類小分子活性肽的重組表達都具有借鑒意義。

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