含組氨酸標簽的小分子抗體臨床應用現狀

劉曉，屈琳，黃昌發，余馨，羅勤

單鏈抗體（scFv）是由免疫球蛋白的重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL）通過一條連接肽，如 (GGGGS)4連接而成的小分子抗體（圖 1）。與全抗相比，它因分子小、容易進入實體腫瘤、體內清除快、免疫原性低、成像清晰等優點成為目前醫用抗體研究的熱點[1]。另外，單鏈抗體易于實現基因操作，可采用微生物細胞規模生產，因而相對于哺乳動物細胞生產線，其制造成本低，在制藥工業得到了廣泛的應用。重組蛋白質藥物生產的關鍵技術之一是目的蛋白的純化，即如何將重組蛋白從微生物細胞產生的總蛋白中分離純化出來。使用蛋白標簽進行親和純化是目前最有效的蛋白分離純化方法。近年來，多種蛋白標簽相繼發明應用。其中，組氨酸標簽 [(His)6-Tag] 由于其分子量小，被廣泛應用于重組蛋白的親和純化。此外，組氨酸標簽還可用于蛋白的定性定量檢測，最近還發現組氨酸標簽可用于特定同位素標記。因此，組氨酸標簽在醫用蛋白，包括小分子抗體中的應用已經越來越普遍。本文綜述了含組氨酸標簽小分子抗體在生物制藥領域中的應用現狀，以期為組氨酸標簽在重組蛋白藥物中的應用提供有價值的參考。

圖 1 抗體結構圖

1 組氨酸標簽簡介

組氨酸標簽一般由連續 6 個組氨酸組成，即 (His)6，連續 5 ～ 9 個組氨酸標簽也有報道，可直接連接到蛋白N-端或 C-端，產生融合蛋白，一般不影響蛋白的結構及功能。組氨酸標簽特定結合 NTA（氨基三乙酸）金屬離子絡合物（圖 2），其親合力為 1 μmol/L。Ni2+是常用的金屬離子，其他離子，如 Co2+、Cu2+、Zn2+也可使用。

NTA 可固定到不同的固相載體上，從而產生不同類型的層析柱。固定化金屬親和層析（immobilised metal affinity chromatography，IMAC）是廣泛使用的親和分離純化技術[2]。該技術操作簡單、快速，可在天然或變性條件下，一步將目標蛋白從總細胞液中分離出來。許多酶或熒光標記的特定抗體和 NTA 衍生物也相繼出現，它們都是檢測組氨酸標簽的靈敏試劑。

圖 2 Ni-NTA 與組氨酸標簽結合示意圖

2 組氨酸標簽是特定的同位素標記位點

將放射性同位素與特定的抗體進行偶聯，可以產生理想的靶向分子。這樣的靶向分子既可以作為體內腫瘤定位“顯影”試劑，也可作為腫瘤治療性分子。然而，如何定點標記小分子抗體一直是抗體藥物研發的焦點。

診斷藥物的標記方法應該是可在常溫下操作的，具有可重復性、高效性和特異性，且不影響標記蛋白活性。目前廣泛采用的賴氨酸標記法，因蛋白質本身賴氨酸含量高，易造成標記分子嵌入蛋白結合區域，從而使蛋白質失活。Cai等[3]研究表明，一種 CEA 雙特異抗體用 N-琥珀酰亞胺4-[18F] 氟苯甲酸酯標記后，其免疫活性僅為原來的 57%。Tavaré 等[4]發現采用非特異性的“氨基酸定向標記”方法標記細胞死亡 SPECT 顯影試劑 C2A，導致 C2A 不能與靶點結合，然而采用新的 C-末端組氨酸標簽作為標記位點，則完整保留了其蛋白質功能。

組氨酸標記法操作簡便，只需要將同位素衍生物與帶有組氨酸標簽的小分子簡單混勻即可，該法穩定、高效、特異性好。Tavaré 等[4]首次將組氨酸標簽和半胱氨酸殘基聯合作為重組蛋白的標記位點，在 C2AcHd 的 C-端額外加上CKLAAALEHHHHHH 序列。結果表明常溫下（37 ℃，10 min）同位素化合物三羰基锝 [99mTc(CO)3]+標記效率和比放射性均高于僅加入組氨酸標簽（C2AcH-A，～ 83%；C2AcH-F，～ 60%） 或僅加入半胱氨酸殘基（C2Ac，～ 15%）。用瞬時薄層色譜（ITLC）測量放射量，C2AcH 濃度在1 μg/μl 以下，其標記率通常高于 96%；使用三羰基錸[Re(CO)3]+標記的質譜結果表明，即使標記物濃度超過蛋白質濃度 10 倍情況下，C2AcH 與 [Re(CO)3]+的結合效率未見增加，也沒有證據表明其與 C2Ac 結合。Waibel 等[5]將此方法應用于帶有組氨酸的一種醫用小分子抗體，獲得了高活性的 99 mTc 標記分子（90 mCi/mg），而且該標記的抗體在體內非常穩定，其藥代動力學及體內分布均與共價鍵非定點碘標記的抗體無區別。由于這種定點標記新技術可用于標記不同的同位素，所以此方法不僅可以標記抗體診斷“顯影”試劑，還可用于標記治療性抗體[5]。

目前，一些同位素標記組氨酸標簽的小分子抗體正應用于腫瘤臨床研究[6]。試驗表明，這種標記的放射自顯影小分子抗體不僅體內穩定性良好，而且能準確定位人體腫瘤。另外，此方法也被用于標記其他蛋白藥物，進行不同時期的臨床研究[7]。

3 組氨酸標簽的非免疫原性

由于越來越多帶有組氨酸標簽的小分子抗體進入不同時期的臨床研究。人們開始關心組氨酸標簽在人體內的安全性。近幾年來，一些研究機構相繼報道了帶有組氨酸標簽的重組蛋白在人體是非免疫原性的，不會影響其在臨床上的應用。Kennedy 等[8]將頂膜抗原 1（AMA1）基因使用畢赤酵母進行表達，純化得到帶有組氨酸標簽的 AMA1 抗原。將抗原對兔子進行免疫，產生了高效價的抗 AMA1 抗體。AMA1 疫苗的成人、兒童臨床 I 期試驗結果表明疫苗具有良好的耐受性，未觀察到疫苗相關的異乎尋常的、嚴重的不良反應。在臨床 I 期研究基礎上，進行了臨床 II 期試驗，同樣未觀察到疫苗引起的嚴重的不良反應[9-12]。最近，英國倫敦大學癌癥研究中心專門對帶有組氨酸標簽的小分子抗體在人體中的免疫原性問題進行了系統性研究。通過重復注射帶有組氨酸標簽的小分子抗體，并采用高靈敏度的熒光檢測免疫原性反應，結果表明：盡管患者對小分子抗體的其他組分產生了強烈的免疫反應，但其組氨酸標簽未表現出任何免疫原性[13]。該研究證明了含有組氨酸標簽的小分子抗體是安全的，對人體是非免疫原性的。

4 含組氨酸標簽小分子抗體的臨床研究

小分子抗體正成為當今新藥研發的趨勢。至 2009 年已有 19 種小分子抗體進入臨床研究，包括臨床 III 期研究[14]。其中，大部分小分子抗體帶有組氨酸標簽。

帶有組氨酸標簽的抗癌胚抗原（CEA）小分子抗體-酶融合蛋白已經進入癌癥治療的臨床 I 期、II 期試驗。帶有6 個組氨酸的單鏈抗體 CIGB-M3（center for genetic engineering and biotechnology M3）通過基因工程手段在大腸桿菌中可溶表達，能特異地和癌胚抗原 CEA 結合[15]。臨床I 期結果表明，17 例結直腸癌患者接受131I 標記的CIGB-M3 注射后，沒有出現嚴重的藥物反應；并且注射后6 個月內，患者血清中沒有檢測到抗 CIGB-M3 的抗體[16]。125I 標記的 CEA 小分子抗體 MFE-23-his也正用于放射性免疫介導手術的臨床 I 期試驗。34 例結腸癌患者（17 例原發性腫瘤、16 例肝轉移、1 例復發）以及 1 例肝轉移的胰腺癌患者在手術前 24、48、72 或 96 h 分別接受125I 標記的 CEA 小分子抗體注射。結果顯示125I 標記 CEA 抗體 MFE-23-his，在血液中清除快，具有良好的腫瘤定位能力，總體精確度達到 84%[17]。該產品已經成功應用于表達CEA 的乳腺腫瘤和骨髓瘤在人體內的顯影[18]。另外，與上皮細胞生長因子（EpCAM）靶向結合的小分子抗體VB4-845 已完成膀胱癌治療的臨床 I 期試驗，試驗結果表明帶有組氨酸標簽的 VB4-845 是安全有效的[19]。使用VB4-845 與假單胞菌外毒素 A 融合而成的融合蛋白，對頭頸部鱗狀細胞癌患者每周進行瘤內注射的 I 期臨床試驗也表明 VB4-845 瘤內療法是安全可行的[20]，87.5%（臨床I 期試驗總共 20 例晚期或者復發性頭頸部鱗狀細胞癌）的EpCAM 陽性患者對 VB4-845 療法具有療效反應。

5 小結

組氨酸標簽是一種多功能標簽，正廣泛應用于重組蛋白包括小分子抗體的親和純化、定性定量檢測及同位素定點標記。臨床試驗表明組氨酸標簽對人體是非免疫原性的。目前已有越來越多帶有組氨酸標簽的小分子抗體進入臨床研究。

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