結核病新疫苗的免疫毒理學評價方法研究

都偉欣 董娜 陳保文 徐苗 楊蕾 盧錦標 沈小兵 王國治

隨著疫苗臨床應用中不良反應報道越來越多，疫苗研發過程中的安全性評價日益引起人們的重視。由于疫苗的作用機理是引起機體免疫系統的應答，故疫苗接種后的多數不良反應是由免疫系統引起的毒性反應［1］。為了保證疫苗在人體應用的安全性，我國從2002年開始要求新型疫苗作臨床前的免疫毒性分析。

疫苗的免疫毒性主要包括：免疫抑制、超敏反應和自身免疫三大類。但其中超敏反應最為常見，而超敏反應中又以Ⅰ型過敏反應最為常見與兇險。Ⅰ型過敏反應多為全身性反應，目前對其評價大多依靠全身主動過敏試驗和被動皮膚過敏試驗，所用的實驗動物模型仍多為大鼠和小鼠。但這些方法均主觀性較強，并且難以量化。而豚鼠是公認的對致敏物質比較敏感的動物，并且與人類Ⅰ型過敏反應發病狀態較為接近［2－3］。本研究以豚鼠為過敏反應動物模型，初步建立了評價Ⅰ型過敏反應的幾種量化檢測指標和方法，并將建立的方法初步應用到結核病新疫苗（恥垢疫苗）的免疫毒性評價中。

材料和方法

一、材料

1.試劑和耗材：雞卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）和 Al（OH）3（0.5 mg/ml）由北京生物制品研究所惠贈。羊抗豚鼠IgG1抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗豚鼠IgG1抗體購于Ab D Serotec公司。四甲基聯苯胺（TMB）底物顯色液購于Amresco公司。豚鼠淋巴細胞分離液購于天津灝洋生物。Hank液、刀豆球蛋白A（concanavalin A，Con A）、臺氏液、紅細胞裂解液購于北京欣經科生物有限公司。15及50 ml離心管、96和24孔酶標板（Corning公司）均購于希爾誠公司。組胺檢測試劑盒（histamine enzyme immunoassay kit）和白三烯檢測試劑盒（leukotriene C4 EIA kit）購于Cayman公司。其他試劑和耗材均為中國食品藥品檢定研究院提供。

2.儀器：酶標儀：Labsystems Dragon公司；離心機：Eppendorf公司。

3.豚鼠：品系：Hartley，無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級，由中國食品藥品檢定研究院實驗動物中心提供。

二、方法

（一）豚鼠Ⅰ型過敏反應模型的制備

首先制備免疫原［含0.05 mg/ml Al（OH）3和1 mg/ml OVA］，方法是取120 mg OVA溶于48 ml生理鹽水中，另取12 ml Al（OH）3與60 ml生理鹽水充分混勻后，邊振蕩邊加入已溶解的OVA，4℃振蕩過夜即可。然后將體質量300～350 g的雄性豚鼠按照數字表法隨機分為過敏模型組和生理鹽水對照組（簡稱對照組），其中過敏模型組30只，對照組15只。最后免疫豚鼠，取1 ml免疫原，過敏模型組中每只豚鼠背部皮下多點注射進行初次免疫。此后每2周加強免疫1次，加強免疫時取1 ml同樣免疫原對每只豚鼠進行肌內注射，共加強免疫3次。對照組以生理鹽水代替免疫原對豚鼠進行注射，注射方式同過敏模型組。

（二）豚鼠血清總IgG1抗體檢測方法的建立

將過敏模型組和對照組豚鼠在末次免疫后7 d進行心臟取血并分離血清，應用棋盤滴定法建立豚鼠血清總IgG1抗體檢測方法。實驗步驟為：分別以1、2、4、6、8、10μg/ml濃度的羊抗豚鼠IgG1抗體包被酶標板。包被結束并洗板后，每孔加入200μl封閉液在室溫下進行封閉。封閉結束并洗板后，分別加入1∶103、1∶104和1∶105稀釋的豚鼠血清，同時做空白對照和試劑對照，每孔100μl，室溫孵育2 h。孵育結束并洗板后，每孔加入200μl 1∶20 000和1∶50 000稀釋的HRP標記的羊抗豚鼠IgG1抗體，室溫孵育2 h。孵育結束并洗板后，每孔加入200μl TMB底物顯色液，避光孵育5 min。每孔加入50μl的2 mol/L H2SO4終止反應。于酶標儀上讀取每孔A450值。數據處理：分別計算陽性孔與陰性對照孔的比值（P/N），按照P/N值＞2.1為陽性。

（三）豚鼠不同組織來源的過敏性介質（組胺和白三烯）含量檢測方法的建立

1.外周血嗜堿粒細胞的分離和體外刺激分泌過敏性介質方法的建立：首先從過敏模型組和對照組豚鼠中按照數字表法分別隨機選擇10只和5只進行心臟取血，每只取血約4 ml，取血后迅速注入抗凝管中，顛倒混勻。然后應用豚鼠淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞。外周血單個核細胞分離后應用紅細胞裂解液裂解細胞。裂解結束后，用1 ml Hank液進行重懸。重懸后顯微鏡下計數，將細胞濃度調至1×106/ml。將調好濃度的各管細胞懸液于37℃孵育10 min后充分振蕩彈勻。每管取細胞懸液300μl，加入等量的 OVA（1 mg/ml）液進行體外刺激分泌過敏性介質；同時每管取細胞懸液300μl，加入等量的 Con A（10μg/ml）液作陽性對照；每管另取細胞懸液300μl，加入等量生理鹽水作陰性對照。將所有管置37℃水浴45 min進行刺激培養。培養結束后，所有管均離心，離心條件：25℃，720×g離心10 min，離心結束后取上清液即可。

2.支氣管肺泡灌洗液收集方法的建立：按照數字表法隨機選擇過敏模型組10只和對照組豚鼠5只，在末次免疫后7 d，從后肢靜脈注射1 mg/ml OVA溶液予以激發。激發后麻醉豚鼠，進行支氣管插管術取支氣管肺泡灌洗液。方法是用注射器緩慢注入37℃預熱的無菌生理鹽水2.5 ml，保留30 s后抽出，重復進行4次，收集全部支氣管肺泡灌洗液，總計約10 ml。將收集的支氣管肺泡灌洗液液置無菌15 ml離心管中進行離心，離心條件：4℃，444×g離心10 min，離心結束后取上清液即可。

3.腹腔灌洗液中肥大細胞的分離和體外刺激分泌過敏性介質方法的建立：按照數字表法隨機選擇過敏模型組10只和對照組豚鼠5只，末次免疫結束后斷頸處死，用20 ml臺氏液（含肝素鈉5 IU/ml）對豚鼠進行腹腔注射吸取腹腔灌洗液。將腹腔灌洗液置于50 ml無菌離心管中進行離心，離心條件：4℃，720×g離心15 min，離心結束后棄上清收集細胞沉淀。加入1 ml紅細胞裂解液于細胞沉淀中，4℃，444×g離心5 min，離心結束后棄上清。用臺氏液重懸細胞沉淀并洗滌細胞2次后，用1 ml臺式液重懸細胞進行鏡下計數，調細胞濃度至2×106/ml。取24孔培養板，每孔加入0.1 ml的OVA液（1 mg/ml）、0.9 ml臺氏液和1 ml細胞懸液體外刺激肥大細胞分泌過敏性介質。陰性對照為每孔加入0.1 ml無菌生理鹽水、0.9 ml臺氏液和1 ml細胞懸液。加樣完畢后，將培養板置37℃孵箱中刺激培養30 min。培養結束后進行離心，離心條件：4℃，405×g離心15 min，離心結束后取上清液即可。

4.ELISA法檢測各樣本中過敏性介質（組胺和白三烯）的含量：（1）組胺含量的檢測：應用Histamine Enzyme Immunoassay試劑盒對上述“1～3”段中的各樣本組胺含量進行檢測。不同來源樣本處理方式有差異，其中外周血嗜堿粒細胞體外刺激培養上清液樣本用Hank液做4倍稀釋；支氣管肺泡灌洗液的上清液樣本用酶免疫試驗（EIA）緩沖液做5倍稀釋；腹腔灌洗液中肥大細胞體外刺激培養上清液樣本用臺氏液做4倍稀釋。不同樣本檢測中標準品制備所用的稀釋液與待測樣本的稀釋液相一致，即分別以Hank液、EIA緩沖液和臺氏液稀釋制備標準品。檢測步驟完全按照試劑盒說明書進行操作。（2）白三烯含量的檢測：應用Leukotriene C4 EIA試劑盒對上述“1～3”段中的各樣本組白三烯含量進行檢測。不同來源樣本處理方式有差異，其中外周血嗜堿粒細胞體外刺激培養上清液樣本和腹腔灌洗液中肥大細胞體外刺激培養上清液樣本直接檢測；支氣管肺泡灌洗液的上清液樣本用EIA緩沖液做2倍稀釋后檢測。不同樣本檢測中標準品制備所用的稀釋液與待測樣本的所含溶液或稀釋液相一致，即分別以Hank液、EIA緩沖液和臺氏液稀釋制備標準品。檢測步驟完全按照試劑盒說明書進行操作。

（四）應用以上建立的Ⅰ型過敏反應的各項指標評價結核病新疫苗（恥垢疫苗）的免疫毒性

1.動物分組和免疫：Hartley豚鼠，雄性，體質量300～350 g，將豚鼠按照數字表法隨機分為3組，分別為恥垢疫苗組、過敏模型陽性組和生理鹽水陰性對照組，每組12只。恥垢疫苗組：以濃度35μg/ml的恥垢疫苗原液后腿肌內注射豚鼠，每只0.5 ml，每2周加強免疫1次，共免疫4次。過敏模型陽性組和生理鹽水陰性對照組免疫方式同豚鼠Ⅰ型過敏反應模型的制備。

2.血清中總IgG1抗體水平檢測：以上各組豚鼠中按照數字表法隨機選取8只，心臟采血后分離血清。應用“豚鼠血清總IgG1抗體檢測方法的建立”中已建立的ELISA方法檢測豚鼠血清中總IgG1抗體水平。其中羊抗豚鼠IgG1抗體包被濃度為6μg/ml，豚鼠血清稀釋度為1∶105，HRP標記的羊抗豚鼠IgG1抗體稀釋度為1∶20 000。具體實驗步驟同上面“豚鼠血清總IgG1抗體檢測方法的建立”段所述。

3.不同組織來源的過敏性介質（組胺和白三烯）評價指標的檢測：（1）不同組織來源樣本的制備：以上各組豚鼠中按照數字表法隨機選取6只，心臟取血分離外周血嗜堿粒細胞，然后進行支氣管插管術取支氣管肺泡灌洗液。各組再按照數字表法隨機選取另外6只，經注射器取腹腔灌洗液中分離的肥大細胞。制備過程同上面“豚鼠不同組織來源的過敏性介質（組胺和白三烯）含量檢測方法的建立”段所述。（2）組胺含量的檢測：外周血嗜堿粒細胞體外刺激培養上清液樣本、支氣管肺泡灌洗液樣本和腹腔灌洗液中肥大細胞體外刺激培養上清液樣本中組胺含量檢測同上面“組胺含量的檢測”段所述。（3）白三烯含量的檢測：外周血嗜堿粒細胞體外刺激培養上清液樣本、支氣管肺泡灌洗液樣本和腹腔灌洗液中肥大細胞體外刺激培養上清液樣本中白三烯含量檢測同上面“白三烯含量的檢測”段所述。

結 果

一、豚鼠血清總IgG1抗體檢測方法的建立結果

總IgG1抗體棋盤滴定結果：確定6μg/ml羊抗豚鼠IgG1抗體包被，待測血清稀釋1∶105，以及HRP標記的羊抗豚鼠IgG1抗體稀釋1∶20 000的條件為最佳實驗條件，以此為條件建立豚鼠血清中總IgG1抗體檢測方法。

二、豚鼠過敏模型中不同組織來源的過敏性介質（組胺和白三烯）含量檢測結果

（一）組胺含量檢測結果

1.外周血嗜堿粒細胞體外刺激培養上清中組胺含量檢測結果：ELISA法檢測模型組和對照組外周血嗜堿粒細胞體外刺激培養上清中的組胺含量。實驗結果顯示：過敏模型組中組胺含量為（99.37±15.34）nmol/L，而對照組中組胺含量為（29.94±5.86）nmol/L。兩樣本經t檢驗，過敏模型組中組胺含量與對照組比較差異有統計學意義（t＝12.60，P＜0.05）。見圖1。

圖1 過敏模型組和對照組中不同組織來源的樣本上清液組胺含量的檢測結果

2.支氣管肺泡灌洗液上清中組胺含量檢測結果：ELISA法檢測模型組和對照組支氣管肺泡灌洗液上清中組胺含量。實驗結果顯示：過敏模型組中組胺含量為（73.42±18.60）nmol/L，而對照組中組胺含量為（31.00±12.09）nmol/L。兩樣本經t檢驗，過敏模型組中組胺含量與對照組比較差異有統計學意義（t＝5.41，P＜0.05）。見圖1。

3.腹腔肥大細胞體外刺激培養上清中組胺含量檢測結果：ELISA法檢測模型組和對照組腹腔肥大細胞體外刺激培養上清液中組胺含量。實驗結果顯示：過敏模型組中組胺含量為（39.59±12.94）nmol/L，而對照組中組胺含量為（14.35±5.85）nmol/L。兩樣本經t檢驗，過敏模型組中組胺含量與對照組比較差異有統計學意義（t＝5.20，P＜0.05）。見圖1。

（二）白三烯含量檢測結果

1.外周血嗜堿粒細胞體外刺激培養上清中白三烯含量檢測結果：ELISA法檢測模型組和對照組外周血嗜堿粒細胞體外刺激培養上清中的白三烯含量。實驗結果顯示：過敏模型組中白三烯含量為（13.09±3.87）pg/ml，而對照組中白三烯含量為（2.22±0.53）pg/ml。兩樣本經t檢驗，過敏模型組中白三烯含量與對照組比較差異有統計學意義（t＝8.46，P＜0.05）。見圖2。

圖2 過敏模型組和對照組中不同組織來源的樣本上清液白三烯含量的檢測結果

2.支氣管肺泡灌洗液上清中白三烯含量檢測結果：ELISA法檢測模型組和對照組支氣管肺泡灌洗液上清中白三烯含量。實驗結果顯示：過敏模型組中白三烯含量為（123.20±16.57）pg/ml，而對照組中白三烯含量為（39.05±16.94）pg/ml。兩樣本經t檢驗，過敏模型組中組胺含量與對照組比較差異有統計學意義（t＝9.15，P＜0.05）。見圖2。

3.腹腔肥大細胞體外刺激培養上清中白三烯含量檢測結果：ELISA法檢測模型組和對照組腹腔肥大細胞體外刺激培養上清液中白三烯含量。實驗結果顯示：過敏模型組中白三烯含量為（6.79±2.58）pg/ml，而對照組中白三烯含量為（3.09±1.18）pg/ml。兩樣本經t檢驗，過敏模型組中白三烯含量與對照組比較差異有統計學意義（t＝3.85，P＜0.05）。見圖2。

三、結核病新疫苗（恥垢疫苗）評價中豚鼠血清總IgG1抗體檢測結果

ELISA法分別對生理鹽水陰性對照組、過敏模型陽性對照組和恥垢疫苗組豚鼠血清中總IgG1抗體進行測定。實驗結果顯示：恥垢疫苗組豚鼠血清中總IgG1抗體A值為0.179±0.03，與生理鹽水陰性對照組（A 值為0.156±0.05）相近，低于過敏模型陽性對照組總IgG1水平（A值為1.768±0.13）。經兩樣本t檢驗，恥垢疫苗組與過敏模型陽性對照組比較差異有顯著統計學意義（t＝33.68，P＜0.01），與生理鹽水陰性對照組比較差異無統計學意義（t＝－1.06，P＞0.05）。見圖3。

圖3 恥垢疫苗與對照組總IgG1抗體水平檢測結果

四、結核病新疫苗（恥垢疫苗）評價中豚鼠過敏性介質（組胺和白三烯）含量檢測結果

（一）組胺含量檢測結果

1.外周血嗜堿粒細胞體外刺激培養上清中組胺含量檢測結果：對各組豚鼠外周血嗜堿粒細胞體外刺激培養上清液中組胺含量進行測定。實驗結果顯示：恥垢疫苗組組胺含量［（61.64±21.62）nmol/L］，與生理鹽水陰性對照組［（59.22±16.55）nmol/L］相近，低于過敏模型陽性對照組的組胺含量（128.3±61.5 nmol/L）。經兩樣本t檢驗，恥垢疫苗組與過敏模型陽性對照組比較差異有統計學意義（t＝2.50，P＜0.05），與生理鹽水陰性對照組比較差異無統計學意義（t＝－0.22，P＞0.05）。見圖4。

圖4 恥垢疫苗與對照組中不同組織來源的樣本上清液組胺含量的檢測結果

2.支氣管肺泡灌洗液上清中組胺含量檢測結果：對各組豚鼠支氣管肺泡灌洗液上清液中組胺含量進行測定。實驗結果顯示：恥垢疫苗組組胺含量［（53.2±25.5）nmol/L ］與生理鹽水陰性對照組［（42.58±16.1）nmol/L］相近，低于過敏模型陽性對照組的組胺含量［（119.5±60.8）nmol/L］。經兩樣本t檢驗，恥垢疫苗組與過敏模型陽性對照組比較差異有統計學意義（t＝－2.46，P＜0.05），與生理鹽水陰性對照組比較差異無統計學意義（t＝0.87，P＞0.05）。見圖4。

3.腹腔肥大細胞體外刺激培養上清中組胺含量檢測結果：對各組豚鼠腹腔肥大細胞體外刺激培養上清中組胺含量進行測定。實驗結果顯示：恥垢疫苗組組胺含量［（24.52±6.69）nmol/L］與生理鹽水陰性對照組［（23.08±5.56）nmol/L］相近，低于過敏模型陽性對照組的組胺含量［（44.92±14.19）nmol/L］。經兩樣本t檢驗，恥垢疫苗組與過敏模型陽性對照組比較差異有統計學意義（t＝－3.19，P＜0.05），與生理鹽水陰性對照組比較差異無統計學意義（t＝0.41，P＞0.05）。見圖4。

（二）白三烯含量檢測

1.外周血嗜堿粒細胞體外刺激培養上清中白三烯含量檢測結果：對各組豚鼠外周血嗜堿粒細胞體外刺激培養上清液中白三烯含量進行測定。實驗結果顯示：恥垢疫苗組組胺含量［（9.89±6.36）pg/ml］與生理鹽水陰性對照組［（6.91±1.92）pg/ml］相近，低于過敏模型陽性對照組的白三烯含量［（19.98±6.74）pg/ml］。經兩樣本t檢驗，恥垢疫苗組與過敏模型陽性對照組比較差異有統計學意義（t＝－2.67，P＜0.05），與生理鹽水陰性對照組無統計學差異（t＝1.10，P＞0.05）。見圖5。

圖5 恥垢疫苗與對照組中不同組織來源的樣本上清液白三烯含量的檢測結果

2.支氣管肺泡灌洗液上清中白三烯含量檢測結果：對各組豚鼠支氣管肺泡灌洗液上清液中白三烯含量進行測定。實驗結果顯示：恥垢疫苗組組胺含量［（28.94±21.55）pg/ml］與生理鹽水陰性對照組［（25.39±20.14）pg/ml］相近，低于過敏模型陽性對照組的白三烯含量［（79.8±36.3）pg/ml］。經兩樣本t檢驗，恥垢疫苗組與過敏模型陽性對照組比較差異有統計學意義（t＝－2.95，P＜0.05），與生理鹽水陰性對照組比較差異無統計學意義（t＝0.29，P＞0.05）。見圖5。

3.腹腔肥大細胞體外刺激培養上清中白三烯含量檢測結果：對各組豚鼠腹腔肥大細胞體外刺激培養上清中白三烯含量進行測定。實驗結果顯示：恥垢疫苗組組胺含量［（6.64±3.73）pg/ml］與生理鹽水陰性對照組［（2.73±0.68）pg/ml］相近，低于過敏模型陽性對照組的白三烯含量［（11.26±2.52）pg/ml］。經兩樣本t檢驗，恥垢疫苗組與過敏模型陽性對照組比較差異有統計學意義（t＝2.52，P＜0.05），與生理鹽水陰性對照組比較差異無統計學意義（t＝－2.53，P＞0.05）。見圖5。

討 論

結核病新疫苗的研究一直是結核病研究領域的重點，各類型的新疫苗研究進展很快。疫苗最終將應用于人體，其是否具有很好的安全性是疫苗審評部門和研發部門非常關注的問題。通常疫苗的不安全性因素是接種后引發不良反應。臨床統計資料顯示疫苗引起的不良反應中以過敏反應所占比例最大。其中，Ⅰ型過敏反應發生率較高，且最為嚴重。因此，建立Ⅰ型過敏反應的動物模型和可量化的各種免疫毒理學評價指標，并以此來評價結核病新疫苗或其他新疫苗的臨床前安全性將具有很重要的意義。

國外的免疫毒理學研究中多以大鼠和小鼠作為Ⅰ型過敏反應動物模型，但評價方法缺乏可以量化的指標，具有一定的主觀性。豚鼠作為Ⅰ型過敏反應最為敏感的動物，其過敏反應可表現出與人類哮喘相似的病理生理學癥狀，并且豚鼠對分枝桿菌及其相關產品具有高度敏感性。因此，筆者選擇豚鼠作為疫苗特別是結核病疫苗免疫毒性評價的實驗動物模型。同時建立幾種量化的檢測指標和方法進行疫苗的免疫毒性評價。

過敏抗體的產生可以使疫苗引起毒性反應，其中IgE作為過敏反應的主要抗體研究已較為深入和明確。然而，Ig E并不是檢測豚鼠過敏抗體的惟一指標。近年來，IgG及其亞型在過敏反應發生發展中的作用愈來愈受到重視［4－5］。有研究表明，IgG抗體，特別是IgG1抗體同樣參與了豚鼠Ⅰ型過敏反應，甚至有可能是主要過敏抗體［6－7］。并且相比于IgE引起過敏反應作用較為緩慢，IgG抗體在Ⅰ型過敏反應中發生作用更加迅速、短暫。根據豚鼠IgG抗體在過敏反應中的這一特點，筆者選擇血清中IgG1抗體的水平作為疫苗Ⅰ型過敏反應毒理學評價的血清學指標，通過ELISA棋盤滴定實驗建立了總IgG1抗體的檢測方法。實驗結果顯示過敏模型組中的總IgG1抗體水平遠高于對照組，進一步證實IgG1抗體參與了豚鼠過敏反應的發生。

組胺和白三烯均是過敏反應發生的重要因子和炎性介質，其濃度高低可以定量反映Ⅰ型過敏反應的嚴重程度［8－9］。實驗研究中，筆者建立了激發后豚鼠支氣管肺泡灌洗液上清的收集方法、未激發豚鼠外周血嗜堿粒細胞的分離和體外刺激培養方法，以及腹腔灌洗液中肥大細胞分離和體外刺激培養的方法，并對各上清中的組胺和白三烯含量進行了測定。結果顯示，過敏模型組豚鼠各樣本上清中的組胺和白三烯含量均顯著高于對照組。這表明通過檢測這3種樣本中組胺和白三烯的含量，將可能成為評價疫苗是否能夠引發Ⅰ型過敏反應的定量指標。

總IgG1抗體水平檢測、各樣本組胺和白三烯的含量檢測方法建立后，選取恥垢疫苗作為結核病新疫苗的代表，應用已建立的方法對其進行免疫毒性評價。免疫毒性評價除設立疫苗評價組外，同時設立陽性對照組和陰性對照組。結果顯示恥垢疫苗組豚鼠血清總IgG1抗體水平、各樣本上清液中的組胺和白三烯含量均與陰性對照組比較差異無統計學意義，卻與陽性對照組相比差異有統計學意義。實驗結果證明恥垢疫苗具有很好的臨床前安全性。恥垢疫苗是已經取得臨床批件的疫苗，并完成了Ⅰ期臨床研究，臨床研究資料顯示其具有很好的安全性，這與本次實驗的豚鼠模型評價結果相一致。

實驗研究建立了幾種可以量化的免疫毒理學評價指標，這將是國內首次對疫苗可能引起的豚鼠Ⅰ型過敏反應進行客觀、可量化的評價，并為今后對其他各種疫苗特別是結核病疫苗的安全性評價奠定了基礎。

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