冷凍干燥法保藏放線菌菌株32 ～ 39年存活性試驗

蘇靜，王桂蘭，趙儀英，余利巖，劉紅宇

冷凍干燥保藏法，是目前被廣泛采用的一種較理想的保藏方法。文獻報道一般保藏時間達 5 ～ 15 年，所以傳代轉種的間隔是 5 ～ 10 年。國內尚未有保藏時間超過 30 年的文獻報道。本文將 1972 – 1979 年間采用冷凍干燥法保存的 120 株菌種復壯，發現此法保藏的菌株經過 32 ～39 年的保存，總存活率高達 83.3%。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 鏈霉菌屬（Streptomyces）53 個種116 株、游動放線菌屬（Actinoplanes）1 株、諾卡菌屬（Nocardia）2 株、鏈輪絲菌屬（Streptoverticillium）1 株，均來源于本所藥用微生物菌種保藏中心。

1.1.2 傳代斜面[1]高氏一號培養基為廣東環凱微生物科技有限公司產品；ISP2 培養基為碧迪醫療器械（上海）有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 冷凍干燥保存法[2-4]冷凍干燥保藏法是用保護劑制備擬保藏菌種的細胞或孢子懸液于安瓿管中，在低溫下（低于共晶點 10 ～ 20 ℃）將菌懸液凍結，并減壓抽真空，使水升華將樣品脫水，形成完全干燥的固體菌塊。然后在真空條件下融封，造成無氧真空環境，置 4 ℃ 低溫下，使微生物處于休眠狀態，而得以長期保藏。保護劑通常為 10%脫脂牛奶。

1.2.2 菌種復壯 用 70% 酒精棉花擦拭安瓿上部，將安瓿管頂部燒熱，用無菌棉簽蘸冷水，在頂部擦 1 圈，頂部出現裂紋后，用鑷子在裂紋部輕叩一下，敲下已開裂的安瓿管的頂端，用滅菌水溶解菌塊，使用無菌吸管吸取菌懸液涂布于高氏一號和 ISP2 斜面培養基上，于 28 ℃ 培養 25 d。觀察斜面，有 1 個及以上菌落生長視為該菌存活。

2 結果

把從 1972 – 1979 年保存的菌種按照冷凍干燥保藏法的復壯方法進行全面復壯，觀察其菌絲生長情況。共檢測接種放線菌 120 株，其中的 80 株可以產生各種生理活性物質。120 株菌株中有游動放線菌屬 1 株，存活 32 年；諾卡菌屬 2 株，均存活 34 年以上；鏈輪絲菌屬 1 株，存活32 年；鏈霉菌屬 53 個種，116 株，其中 96 株存活32 年以上，總存活率高達 83.3%（表 1）。

表 1 放線菌保藏 32 ～ 39 年后存活情況

續表 1

續表 1

3 討論

在使用冷凍干燥法保藏菌種的過程中，影響菌種存活率的因素很多，如菌種差異，保藏前使用的培養基，菌種的生長狀況，保護劑、凍干曲線是否合適，凍干后的存放地點，復壯條件等。藥用微生物菌種保藏中心從 20 世紀 60 年代末開始采用冷凍干燥技術保藏放線菌。從上述的存活性實驗結果可以看出，采用冷凍干燥法長期保藏放線菌是十分有效的。

在冷凍干燥法的過程中嚴格控制冷凍干燥保藏的各個環節，可以延長菌種保藏時間，提高保藏效率。特別是以下幾個環節值得注意：

⑴選擇易產孢培養基，盡可能縮短待凍干菌種于4 ℃ 冰箱放置時間。

⑵設定合適的凍干曲線。由于過去的小型凍干機層板溫度和真空度無法控制，不能保證樣品在主凍干過程中，溫度始終低于共晶點 10 ～ 20 ℃，造成菌種不能完全在升華狀態下被抽干水分，影響菌種的保藏效果。目前，本中心正在對冷凍干燥整個流程的各個環節進行質量控制，購置了中試型凍干機，全面控制凍干曲線[4]，以延長微生物菌種保藏時間。

[1] Zhang JZ. Microbial taxonomy. Shanghai: Fudan University Press,1990:153-154. (in Chinese)張紀中. 微生物分類學. 上海: 復旦大學出版社, 1990:153-154.

[2] Tokio NEI. Microbial preservatio method. Jin LY, Translation.Shanghai: Shanghai Scientific and Technical Publishers, 1982:5-7. (in Chinese)根井外喜男. 微生物保存法. 金連緣, 譯. 上海: 上海科學技術出版社, 1982:5-7.

[3] Institute of microbiology culture collection manual preparation group. Culture collection manual. Beijng: Science Press, 1980:615-616. (in Chinese)中國科學院微生物研究所菌種保藏手冊編制組. 菌種保藏手冊.北京: 科學出版社, 1980:615-616.

[4] John GD, Glyn NS. Cryopreservation and freeze-drying protocols(Methods in molecular biology). 2nd Ed. Totowa, New Jersey:Humana Press, 2007.