膠體金法結合涂片形態學特征快速鑒別結核分枝桿菌復合群的應用評價

黃明翔 張麗水 陳新朝 毛文捷

我國是結核病高負擔國家之一，患病人群數量巨大，面臨著嚴峻的結核病流行形勢［1］。同時，近年來由于氣候、環境等因素，非結核分枝桿菌（non－tuberculosis Mycobacterium，NTM）感染具有明顯的上升趨勢，2000年調查表明，我國NTM菌株占全部分枝桿菌菌株的11.1%［2］，較1984—1985年的4.2%，1990年的4.9%明顯增高。非結核分枝桿菌感染的臨床癥狀和X線表現與結核相似，難以鑒別，且多數非結核分枝桿菌對抗結核藥物有天然耐藥性，因此正確鑒定結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌對于疾病的診斷和治療至關重要［3］。

傳統的微生物學鑒定方法過于復雜、費時，而分子生物學鑒定方法由于儀器、試劑價格昂貴，也難以在日常的實踐中推廣。臨床迫切需要一種快速、簡易鑒別結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌的方法。本研究運用涂片抗酸染色和結核分枝桿菌抗原膠體金法，對BACTEC MGIT 960培養陽性853株臨床分離株進行菌種鑒定并與傳統生化鑒定方法比較，以評價這兩種方法在分枝桿菌菌種鑒定中的作用。

材料和方法

一、標本及菌株來源

標本來源于我院2011年1—6月門診及住院肺結核或疑似患者，選擇門診及住院的肺結核患者或是咳嗽、咯痰≥2周或有咯血或血痰者等具有肺結核可疑癥狀者為研究人群，所有確診及疑似肺結核患者的診斷均根據《結核病分類》（WS196－2001）中的診斷標準［4］執行。共收集1260例確診肺結核患者和1350例疑似患者的標本進行結核分枝桿菌培養。2610例送檢培養的標本中痰標本1580例，肺泡灌洗液921例，胸腔積液109例。經BACTEC MGIT 960培養共收集培養陽性，抗酸染色證實為分枝桿菌菌株853株。質控菌株：結核分枝桿菌標準菌株 H37Rv（ATCC27294）、偶然分枝桿菌（ATCC6841）來源于北京胸科醫院國家參比實驗室。

二、儀器和試劑

BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌檢測儀及配套試劑為美國BD公司生產。ABI7300熒光定量擴增儀為美國應用生物（Applied Biosystems）公司生產、結核分枝桿菌核酸擴增（PCR）熒光檢測試劑盒為中山大學達安基因股份有限公司生產。抗酸染色液、改良酸性羅氏培養基、對硝基苯甲酸（PNB）、噻吩－2－羧酸肼（TCH）培養基及生化鑒定的試劑為本實驗室參照中國防癆協會制定的《結核病診斷細菌學檢驗規程》［5］自配。結核分枝桿菌膠體金檢測試劑盒購自杭州創新生物檢控技術有限公司。

三、實驗方法

（一）分枝桿菌培養和涂片檢查

送檢標本經2～3倍消化液（30 mmol N－乙酰基L－半胱氨酸＋2%氧化鈉＋2%檸檬酸三鈉）消化處理15 min后，加生理鹽水稀釋至50 ml，4200轉/min（離心半徑15 cm）離心20 min后，棄去上清，用2～3 ml生理鹽水稀釋沉淀物，取約50μl接種到BACTEC MGIT 960培養管。一旦有陽性，系統會報告，從培養管里取樣做抗酸染色，在1000倍普通光學顯微鏡下觀察和記錄。

（二）傳統菌種鑒定實驗

1.結核分枝桿菌復合群與非結核分枝桿菌傳統生化鑒定實驗：應用PNB和TCH鑒別培養基生長實驗對菌種進行初步鑒定，操作步驟參照《結核病診斷細菌學檢驗規程》［5］進行。鑒定結果：結核分枝桿菌復合群PNB陰性TCH陽性；非結核分枝桿菌PNB陽性TCH陽性。

2.分枝桿菌菌種鑒定實驗：按照中國防癆協會制定的《結核病診斷細菌學檢驗規程》［6］的方法進行。

（三）結核分枝桿菌復合群實時熒光定量PCR鑒定

1.操作步驟：取1 ml混勻后的培養菌液，15 000 r/min（離心半徑8 cm），離心5 min，棄上清，沉淀加無菌生理鹽水1 ml打勻15 000轉/min（離心半徑8 cm），離心5 min，再重復1次，沉淀加50μl DNA提取液，置沸水浴10 min。10 000 r/min（離心半徑8 cm），離心5 min，取上清液2μl，加入成品的結核分枝桿菌核酸擴增（PCR）熒光檢測試劑盒中（包含引物、耐熱DNA聚合酶、四種核苷酸單體等），按儀器說明進行PCR反應。

2.結果判定：依照說明書設定陰性質控品擴增循環數（Ct值）為≥30，臨界陽性質控品Ct值為27～29，強陽性質控品Ct值為＜22。當陰性質控品Ct值＞臨界陽性質控品Ct值＞強陽性質控品Ct值時，判定實驗有效，在此前提下根據檢測標本的Ct值判定結果，如果檢測標本的Ct值≥30則判定為陰性，Ct值＜30則為陽性。

（四）結核分枝桿菌抗原膠體金法快速診斷實驗

從培養陽性MGIT 960試管中取100μl樣品加入結核分枝桿菌膠體金檢測試劑盒的檢測孔中，15 min后觀察結果。結果判定：檢測區和控制區均出現紫紅色條帶為陽性結果，在控制區出現紫紅色條帶，在檢測區未出現為陰性結果。控制區未出現任何條帶需重新檢測。

四、統計學方法

采用敏感度、特異度、陽性預測值（positive predictive value，PPV）和陰性預測值（negative predictive value，NPV）評價實驗方法陽性的有效性。敏感度＝真陽性/（真陽性＋假陰性）；特異度＝真陰性/（真陰性＋假陽性）；PPV＝真陽性/（真陽性＋假陽性）；NPV＝真陰性/（真陰性＋假陰性）。

結 果

一、BACTEC MGIT 960培養及鑒定結果

2610例臨床標本BACTEC960培養陽性，經抗酸染色證實為分枝桿菌853株（32.7%）。經過傳統生化反應鑒定其中結核分枝桿菌復合群760株，非結核分枝桿菌91株，結核分枝桿菌復合群和非結核分枝桿菌混合生長2株。鑒定結果見表1。

表1 傳統生化反應對853株菌種分類的鑒定結果

圖1～4 液體培養基沉淀物涂片抗酸染色形態。圖1示結核分枝桿菌復合群呈典型索狀生長（抗酸染色 ×1000）；圖2示龜分枝桿菌呈團塊排列（抗酸染色 ×1000）；圖3示鳥－胞內分枝桿菌復合體呈團塊排列（抗酸染色 ×1000）；圖4示膿腫分枝桿菌呈散在分布（抗酸染色 ×1000）

二、BACTEC MGIT 960中分枝桿菌涂片抗酸染色結果

經傳統生化方法鑒定為結核分枝桿菌復合群760株中，經吸取液體培養基沉淀物涂片抗酸染色呈索狀排列的有748株，非索狀排列的12株，其中束狀排列10株，成團排列2株。非結核分枝桿菌則呈現團塊狀排列、散在分布等不規則排列，3株非結核分枝桿菌包括戈登分枝桿菌1株、偶然分枝桿菌2株呈索狀排列。2株混合生長菌株則同時存在索狀和非索狀排列的情況。涂片法鑒別結核分枝桿菌敏感度為98.4%（750/762），特異度為96.7%（88/91）。PPV為99.6%（750/753）；NPV為88.0%（88/100）。詳見圖1～4及表2。

三、實時熒光定量PCR鑒定結果

760株結核分枝桿菌復合群和2株混合生長株實時熒光定量PCR檢測結果均為陽性；91株非結核分枝桿菌為陰性。

四、結核分枝桿菌復合群抗原膠體金試驗檢測結果

具體見表3。752株結核分枝桿菌復合群和2株混合生長菌株膠體金試驗呈陽性反應，8株結核分枝桿菌復合群呈陰性反應并重復3次試驗仍然呈陰性反應；91例非結核分枝桿菌中90例呈陰性反應，1例鳥胞復合體呈弱陽性反應，該株同樣經過3次重復試驗結果均為弱陽性。膠體金試驗鑒別結核分枝桿菌敏感度為 99.0% （754/762），特 異 度 為98.9%（90/91），PPV 為99.9%（754/755），NPV為91.8%（90/98）。

五、結合涂片抗酸染色和膠體金試驗兩種方法鑒別結核分枝桿菌的結果

結合兩種方法對MGIT 960培養陽性菌株進行判斷，當菌株涂片呈索狀且膠體金陽性時即可判定該菌株含有結核分枝桿菌復合群，PPV為100.0%（741/741）；當菌株涂片不呈索狀且膠體金陰性時可判定該菌株為非結核分枝桿菌，NPV 100.0%（87/87）；當只有其中一種方法陽性時，則需通過傳統PNB法或分子生物學方法進一步進行判斷（表4）。

表2 760株結核分枝桿菌復合群與非結核分枝桿菌抗酸染色檢測菌落排列形態（株）

表3 BACTEC MGIT 960培養陽性分離株膠體金試驗檢測結果（株）

表4 結合涂片抗酸染色和膠體金試驗兩種檢測方法鑒別結核分枝桿菌的結果（株）

討 論

BACTEC MGIT 960系統是一種基于液體培養基的分枝桿菌快速培養系統，針對其陽性培養物的鑒定，目前國內實驗室主要還是采用傳統的鑒定方法，但所需時間長，不能滿足臨床快速診斷的需求。近年來興起的分子生物學技術對實驗室的儀器、實驗人員的能力要求較高，試劑成本昂貴，很難在基層醫院推廣。臨床急需一種快速簡便、準確性高的方法。

在液體培養基中，結核分枝桿菌因含索狀生長因子而在顯微鏡下呈現特有的索狀排列，而非結核分枝桿菌則較少存在索狀因子故呈現團塊狀排列、散在分布等不典型形態，因此索狀排列形態被推薦作為一種結核分枝桿菌復合群的鑒定標準［7］。對于BACTEC MGIT 960分枝桿菌快速培養系統報告陽性的菌株應立即進行涂片抗酸染色，不但可以排除非抗酸菌引起的污染，而且可以通過鏡下形態特征能夠對菌種類型進行初步判斷。本研究結果顯示，快速涂片鑒定的敏感度為98.4%，特異度為96.7%，具有良好的初步判斷能力。國外有研究報道［8］，應用該法鑒定結核分枝桿菌復合群的敏感度、特異度分別為92.1%和96.4%，與本研究結果相近。

結核分枝桿菌抗原膠體金法是一種用單克隆抗體檢測結核分枝桿菌分泌的MPT64（也稱“MPB64”）蛋白的方法，MPT64蛋白主要存在于結核分枝桿菌復合群，非結核分枝桿菌中僅有極少數存在［9］。該方法快速，簡便，不需要特殊的儀器，只需15 min便能得到結果，而傳統的PNB生長試驗需要4周時間。近年來，國內外許多學者均報道了應用該法快速鑒定結核分枝桿菌復合群。如Hillemann等［10］研究表明膠體金法檢測結核分枝桿菌復合群的敏感度為92.4%，特異度為100.0%；國內陳俊林等［11］利用此法對131株分枝桿菌臨床分離株進行檢測，其敏感度為99.1%，特異度為100.0%。在本研究中通過對853株臨床分離株進行檢測，結核分枝桿菌抗原膠體金法的敏感度為99.0%，特異度為98.9%，PPV為99.9%，NPV 為91.8%，與報道基本相符。其中，8株結核分枝桿菌分離株呈陰性反應，它們可能存在MPT64編碼基因突變［12］；另外，1株鳥胞復合體呈弱陽性反應，這株特殊的菌株經過菌種復蘇后重新檢測仍呈陽性反應，同時該株的實時熒光定量PCR檢測結果為陰性，表明該菌株中不存在結核分枝桿菌復合群。國外多個文獻也報道了該法對于不同種類非結核分枝桿菌呈假陽性反應的結果［13－14］，其原因還有待于進一步研究。

本研究顯示，單一使用涂片法或膠體金法進行鑒定，都有可能出現漏診或誤診的現象，而結合兩種方法進行判斷則可大幅度提升診斷的準確程度。當陽性培養物涂片顯示索狀排列且膠體金陽性時，可報告菌株中含有結核分枝桿菌復合群，其陽性預測值為100.0%；兩種方法均為陰性，可報告為非結核分枝桿菌，其陰性預測值為100.0%；而只有任一種方法陽性，則需進一步鑒定。通過結合涂片法和膠體金法兩種方法，853株菌株中97.1%（828株）得到快速鑒定，僅有25株需要進一步鑒定，極大提高了檢驗效率。

另外，需要提到的是91株非結核分枝桿菌中有1株恥垢分枝桿菌，由于本院對于初步鑒定為非結核分枝桿菌的標本都要求患者再次送檢，經過鑒定兩次送檢的標本均為恥垢分枝桿菌，因此可以排除實驗操作、標本留取過程中的污染。同時，病歷資料顯示該患者并沒有處于免疫狀態極其低下的狀況，故考慮該菌為患者體內定植的非致病性細菌。

綜上所述，無論是涂片法還是膠體金法，都是快速、簡便的方法，兩種方法的結合，可提高診斷的準確性，可作為分枝桿菌菌種鑒定的有效方法，且適于各級實驗室使用。

［1］全國第五次結核病流行病學抽樣調查技術指導組.2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告.中國防癆雜志，2012，34（8）：485－508.

［2］全國結核病流行病學抽樣調查技術指導小組.2000年全國結核病流行病學抽樣調查報告.中國防癆雜志，2002，24（2）：102－106.

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