一株產藍色素放線菌的篩選及發酵研究

全桂靜， 邢繼雙

(沈陽化工大學環境與生物工程學院，遼寧沈陽110142)

食用色素是指能使食品著色或改善食品色調和色澤的食品添加劑［1］.它在食品中的含量非常少，但對食品質量及品質的影響非常大，是食品工業中不可缺少的添加劑之一.天然食用色素色澤自然、種類繁多、安全性高，食用天然色素已被廣泛應用于飲料、糖果等食品的著色［2］.研究表明，一些食用天然色素對人體的多種疾病還具有非常突出的治療、預防等藥理作用和保健功能，也可用于醫療保健品、化妝品的著色，能更好地模仿天然物的顏色，著色時的色調比較自然［3］.利用微生物發酵法生產功能性食用天然色素，因其產率高、不受原料產地制約等優勢，逐漸成為當前研究熱點.目前我國準許使用的色素中，藍色素主要是從桅子、螺旋藻、念珠藻、紫甘藍等原料中提取，并對其性質、穩定性進行了研究，但發酵生產藍色素卻不多見［4］.因此，開發和選育出能大量生產天然藍色素的微生物具有一定意義.本文從土壤中篩選出1株藍色素高產菌株產量穩定，以期可以豐富食用藍色素的物種.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

沈陽化工大學院內土壤.

1.1.2 培養基配方

(1)初篩培養基(g/L)［4－5］

可溶性淀粉 20，KNO31.5，K2HPO40.5，NaCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.01，K2Cr2O70.1，瓊脂20，pH=7.5，121℃高壓蒸汽滅菌30 min.

(2)發酵培養基(g/L)

可溶性淀粉 20，KNO31，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.01，NaCl 0.5，pH=7.5，121℃高壓蒸汽滅菌30 min.

1.2 實驗方法

1.2.1 藍色素產生菌株的篩選

(1)初篩:采用10倍稀釋法對土樣進行充分稀釋.將初篩培養基倒入無菌培養皿，凝固制成平板.取1 mL稀釋液涂布于平板上，30℃恒溫培養96 h.

(2)復篩［5］:初篩的菌株轉接斜面后，在恒溫培養箱內30℃培養5 d，制成108/mL單孢子懸液.取1 mL懸液接種于裝有100 mL發酵培養液的250 mL的三角瓶中，30℃、160 r/min條件下培養96 h，測定色素產量.

1.2.2 藍色素產量的測定方法［5－6］

發酵液采用sigma 2-16P臺式高速離心機5 000 r/min離心30 min，取上清液.以空白培養基為對照，利用722型分光光度計在590 nm波長處測A值［5］，以表示發酵液中色素的產量.

1.2.3 藍色素生產條件的研究［5－7］

(1)營養條件的研究:利用常用的糖類及無機、有機含氮化合物分別作為碳源和氮源，250 mL三角瓶中裝100 mL液體培養基，按2%比例接種，在30℃，160 r/min的條件下恒溫振蕩培養96 h，確定適宜的營養條件.

(2)發酵條件的優化:在確定營養條件的基礎上，考察溫度、發酵時間等因素對色素生產的影響，以優化發酵條件.

(3)正交試驗的設計:根據單因素的試驗結果，設計4因素3水平的正交試驗，結果見表1.

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

(4)正交試驗的驗證試驗:按以上正交試驗結果的最優配比，進行發酵重復試驗.

1.2.4 藍色素的提取與色價測定

(1)色素的提取:向90 mL色素粗溶液中滴加2 mol/L的NaOH溶液10 mL，在50℃恒溫水浴鍋中作用30 min使色素充分沉淀，采用sigma 2-16P臺式高速離心機7 800 r/min離心30 min后，干燥即得色素粗提物.

(2)粗提物色價的測定:按1∶100的比例用pH9.0Tris-HCl緩沖溶液溶解色素粗提物，使色素充分溶解［8－9］，用722型可見分光光度計在波長590 nm處測吸光度.按公式

計算色價［10］.式中，A為實測試樣的吸光度;α為稀釋倍數.

2 結果與討論

2.1 藍色素生產菌株的篩選

2.1.1 初篩

土樣經稀釋并在初篩培養基平板上培養后，共篩得7株產水溶性藍色素的放線菌，見圖1.

圖1 藍色素產生菌株的菌苔Fig.1 The lawn of blue pigment producing strain

2.1.2 復篩

對初篩得到的7株菌進行液體發酵，發酵液離心后測A590，結果見表2.由表2可知5號菌株發酵液的A590值較高，命名為Cya-5.

表2 初篩菌株的藍色素產量Table 2 The blue pigment production of the screening strains

2.2 藍色素生產條件的研究結果

2.2.1 碳源對藍色素生產的影響

以20 g/L的蔗糖、甘油、葡萄糖、檸檬酸三鈉、可溶性淀粉等作為碳源，1 g/L的KNO3為氮源，研究藍色素的發酵情況，結果見圖2.

圖2 碳源對藍色素生產的影響Fig.2 The effect of carbon source on the pigment fermentation

由圖2結果可知，碳源對藍色素發酵生產的影響較大，其中以甘油為碳源時，A590最大為5.01，可溶性淀粉次之.因此確定甘油為藍色素發酵用碳源.

2.2.2 氮源對藍色素生產的影響

確定碳源為甘油后，以1 g/L蛋白胨，硫酸銨，硝酸鉀作為氮源，以及不加氮源，研究藍色素產量，結果如圖3所示.由圖3可知，以KNO3為氮源時，A590最大為5.32，可見KNO3有利于藍色素的生產.

圖3 氮源對藍色素生產的影響Fig.3 The effect of nitrogen source on the pigment fermentation

2.2.3 發酵液初始pH值對藍色素生產的影響

配制培養基時，調節不同的pH值，研究初始pH對發酵的影響，結果見圖4.結果顯示，pH對藍色素生產的影響較大，當pH在8.0左右時，A590最大為5.98.這與放線菌的最適生長pH范圍7.5～8.5基本一致.

圖4 初始pH對藍色素生產的影響Fig.4 The effect of initial pH on the pigment fermentation

2.2.4 發酵溫度對藍色素生產的影響

在最適碳源、氮源、pH值的條件下，考察發酵溫度對藍色素產量的影響，結果如圖5所示.由圖5可以看出:當發酵溫度為30～35℃時，色素產量和胞外分泌率都是比較好的，但尤以30℃為最佳.當溫度大于40℃時，該放線菌基本不產藍色素.

圖5 發酵溫度對藍色素生產的影響Fig.5 The effect of temperature on the pigment fermentation

2.2.5 發酵時間對藍色素生產的影響

在以甘油為碳源，硝酸鉀為氮源，pH=8.0，30℃發酵，測量不同發酵時間藍色素的產量，結果如圖6所示.由圖6結果可知，發酵96 h時，A590達到最大值為5.96，因此96 h為藍色素的最佳收獲時間.

圖6 發酵時間對藍色素生產的影響Fig.6 The effect of fermentation time on the pigment fermentation

2.2.6 正交試驗

按4因素3水平的正交實驗表進行發酵實驗，發酵液預處理后，經過10倍稀釋后測定A590，結果及分析見表3.結果顯示最佳組合為A2B2C3D2，即最優培養基配方為:甘油20 g/L，KNO31 g/L，pH值為8.5，裝液量為100 mL/250 mL三角瓶，總A值可達12.02.數據分析顯示，在研究的4個因素中，對發酵影響最大的因素是氮源濃度，其次為碳源濃度.

表3 正交實驗結果表Table 3 Results of orthogonal experiment

按上述正交實驗最優配比，進行驗證實驗，發酵液經預處理后，稀釋10倍后測定A590，發酵中藍色素產量基本穩定，總A590在12.24左右.

2.3 藍色素粗提物的性狀及色價

用2 mol/L NaOH提取，藍色素粗提物的平均得率為64.1 g/100 L.粗提物為不均勻的黑藍色片狀顆粒.關于微生物藍色素的報道中多為粗溶液的研究，僅有報道的藍色素粗提物為紫紅色素粉末［11］，本實驗提取得到的色素為新物質.

在堿性條件下加熱攪拌，促進粗色素溶液中的蛋白質等物質與色素分子結合，并發生沉淀，形成粗提物.將色素粗提物用pH=9.0的緩沖溶液溶解，出現少量的不溶物，溶液在590 nm處測定A值，根據公式計算色價為45.8.

3 結論

利用初篩培養基從土壤中篩選得到7株能產生藍色素的放線菌，其菌落及周圍培養基中擴散有大量水溶性的藍色素.利用液體發酵法對初篩得到的菌株進行復篩，其中有2株放線菌無色素產生，另有1株放線菌的產量突出，命名為cya-5.

對cya-5的發酵條件進行研究，結果顯示藍色素生產的最優培養基配方為甘油20 g/L、KNO31 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，NaCl 0.5 g/L，初始pH值為8.5，其中氮源濃度和碳源濃度對色素產量影響較大;培養溫度為30℃，裝液量為100 mL/250 mL，發酵時間為96 h，發酵液的A590值可達12.02，與張和春等研究的分泌色素量相比較，略高.

堿沉發酵液得到不均勻的黑藍色片狀色素物質，該物質比較穩定，溶解于pH=9的水溶液呈現深藍色.通過測定，該色素粗提物的色價為45.8，較市售的梔子藍色素的色價低，主要原因為粗提物的純度不夠，在以后的研究工作中應進一步純化.

［1］ 張國文.食用色素的研究現狀與前景［J］.糧油食品科技，2004，12(6):17－19.

［2］ 毛得獎，朱亞玲.我國天然藍色素研究現狀［J］.中國食品添加劑，2011，36(10):109－114.

［3］ 車雙輝，杜琪珍，夏明.天然藍色素的研究進展［J］.食品研究與開發，2003，24(2):18－20.

［4］ 趙輝，閆華曉.一株產藍色素海洋鏈霉菌及其色素性質的研究［J］.食品研究與開發，2009，30(6): 186－188.

［5］ 張和春.天藍色鏈霉菌產藍色素的搖瓶發酵優化［J］.食品與發酵，1999，25(5):23－27.

［6］ 陸玲，孫延濤，唐勇，等.一種放線菌發酵產天然藍色素的研究［J］.微生物學通報，2001，28(4):50－54.

［7］ 趙東紅，陸玲，秦懷蘭.一種微生物發酵產藍色素的穩定性及毒性研究［J］.食品與發酵，1998，24 (5):21－24.

［8］ 張和春，陳亮，季文明，等.產藍色素放線菌的初步鑒定和藍色素性質研究［J］.無錫輕工大學學報，1999，18(3):23－28.

［9］ 徐尤智，梁華正，陳賀，等.高色價梔子藍色素的制備及其穩定性研究［J］.現代食品科技，2011，27 (4):440－443.

［10］孫平.食品添加劑［M］.北京:中國輕工業出版社，2004:99－100.

［11］李一葦，陳曉琳，張明.一株產藍色素菌株生物學特性及色素基本性質的研究［J］.生物學雜志2007，24(1):41－43.