聚苯乙烯微孔膜固載辣根過氧化物酶降解苯酚

劉雅祺， 申延明， 樊麗輝， 劉東斌， 陳曉宇

(沈陽化工大學化學工程學院，遼寧沈陽110142)

辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，簡稱HRP)是商品化較早、應用最廣泛的一種酶制劑，從常年生香草辣根中提取，來源廣泛，價格相對低廉［1－3］.能在較寬的溫度、pH值、污染物濃度和鹽度范圍內保持其催化活性.另外，不像其他具有同樣功能的酶，HRP對有機底物的專一性要求不高，胺類、酚類等芳香化合物均可成為其底物，因此特別適合于含多種芳香性物質的工業廢水處理，在含酚廢水，染料廢水等工業廢水處理有著潛在的應用前景［4－5］.由于HRP溶液酶不能重復使用，且其活性會受其他污染物影響而降低，酶使用1次后即成為新的污染物，因此阻礙了酶在廢水處理中的推廣應用［6］.酶經固定化后穩定性大大提高，可重復或連續使用，這樣不僅降低了廢水處理的成本，而且還避免了蛋白質的污染等問題［1］.隨著科學技術的發展，固定化的載體材料已從最初的天然高分子材料發展到合成高分子材料、無機材料以及復合材料等［7］.多孔的高分子化合物具有表面積大，化學穩定性高，具有更好的疏水性和生物兼容性，可作為辣根過氧化物酶的固定材料.本文采用Breath Figures法制得蜂窩狀結構的聚苯乙烯微孔膜，將HRP固定在聚苯乙烯微孔膜上，以自制的苯酚水溶液為模擬溶液，測試固定化HRP酶催化氧化苯酚性能.

1 實驗部分

1.1 主要試劑和儀器

聚苯乙烯(PS，相對分子質量235 000)，遼寧盤錦乙烯有限責任公司;單羧基封端聚苯乙烯(PS-COOH，相對分子質量 50 000)，Scientific polymer products Inc;辣根過氧化物酶，上海源葉生物科技有限公司;其他試劑均為分析純.

T6新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司;XSP-8C生物顯微鏡，上海長方光學儀器有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 蜂窩狀結構微孔膜的制備

將線性聚苯乙烯(PS)和單羧基聚苯乙烯(PS-COOH)按質量比1∶2混合，溶于氯仿中，密封，超聲波震蕩溶解，待完全溶解后，靜置消泡，配置溶液質量濃度為50 g/L.將載玻片在超聲波清洗器中依次用重鉻酸鉀洗液、乙醇及蒸餾水充分清洗，烘干備用.室溫下，在相對濕度65%條件下，用移液器移取約80 μL聚合物溶液澆鑄在載玻片上，立即用經水飽和的濕空氣吹拂溶液表面，空氣流量600 mL/min，待溶劑和水揮發完畢后，制得PS微孔膜.用蒸餾水沖洗，使微孔膜從載玻片上脫落，室溫下烘干待用.

1.2.2 HRP的固定

稱取0.1 g可溶性碳二亞胺溶于10 mL、0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.0)中，在室溫下將制得的微孔膜浸泡0.5 h，取出后用蒸餾水沖洗2～3次，濾紙浸干.

精確稱取酶粉，用0.2 mol/L的PBS(pH= 7.0)配成一定濃度酶液.將0.3 g經活化處理后的微孔膜浸潤在4 mL不同濃度的酶溶液中，低溫下放置一定時間后，用蒸餾水沖洗，低溫保存.合并殘液和沖洗液，測定溶液酶活.

游離和固定化酶活的測定參照文獻［8］.

酶活回收率=［固定化酶總活力/

(原酶液酶活量－

濾液酶酶活量)］×100%.

1.2.3 固定化HRP催化苯酚氧化

采用4-氨基安替比林分光光度法［9］測定水中的苯酚濃度，此法適用于低濃度苯酚溶液，對于高濃度的苯酚溶液，可采用稀釋后測定的方法.

移取1 mL質量分數30%的雙氧水于100 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至100 mL.在100 mL的小燒杯中加入40 mL已知濃度的苯酚溶液，加入一定質量的固定化HRP，緩慢滴入一定體積經稀釋過的雙氧水，低速磁力攪拌，反應一段時間后取出固定化酶，并向反應液中加入少量MnO2，將反應剩余的雙氧水分解.用帶有濾膜(0.45 μm)的20 mL注射器過濾取樣，分析濾液中苯酚的濃度.將使用過的固定化酶用蒸餾水沖洗幾次后低溫保存、待用.

苯酚去除率=［(原溶液中苯酚質量－

處理后溶液中苯酚質量)/

原溶液中苯酚質量］×100%.

2 結果與討論

2.1 HRP的固定化

2.1.1 微孔膜固載HRP前后光學圖片

圖1為固載HRP 3 h前后微孔膜在光學顯微鏡下的照片.

圖1 固定化前后蜂窩狀微孔膜光學顯微鏡下照片(400倍)Fig.1 The optical photos of PS microporous membrane(400 times)immobilization

從圖1(a)可以看出，PS微孔膜具有規則的蜂窩狀結構.Zhang等［10］認為，利用Breath Figures法制備蜂窩狀微孔膜時，在微孔形成過程中，聚苯乙烯上的疏水基團定向地朝向溶液的疏水側排列，而親水基團朝向水滴的一側排列，水滴揮發完之后，親水基團在微孔表面規整排列.在利用Breath Figures法制備蜂窩狀微孔膜時，羧基封端聚苯乙烯上的羧基定向地朝水滴一側排列，這些羧基經碳二亞胺活化后，可與酶分子上的氨基共價結合［11］，羧基的活化及酶的固定化反應如圖2所示.觀察圖1(b)發現，固載后膜表面仍然呈現蜂窩狀結構，但孔壁較固載前明顯變厚，孔徑減小，說明微孔表面經碳二亞胺活化的羧基與HRP連接，HRP固載在微孔表面.

圖2 微孔膜的活化和酶的固定化反應Fig.2 The reactions for activation of membrane and enzyme immobilization

2.1.2 HRP酶溶液質量濃度

載體與酶量的配比對酶的固定化影響較大，酶溶液質量濃度對固定化酶的活性和酶活回收率的影響如圖3所示.

圖3 酶溶液質量濃度對酶固定化的影響Fig.3 The influence of HRP concentration on HRP activity

從圖3可知:隨著酶溶液質量濃度的增加，酶活回收率迅速降低;當酶液質量濃度小于1.0 g/L時，隨酶溶液質量濃度的增大，固定化酶的活性迅速升高;繼續增大酶液質量濃度，固定化趨于穩定，酶活有下降趨勢.其原因可能是:其一，繼續增加酶液質量濃度后，微孔膜能與酶結合的位點達到飽和，此時酶分子相互聚集成團，雖然膜上結合了較多的酶分子，但內層的酶因擴散阻力過大而難以與底物結合，表現不出來酶活;其二，微孔膜上能與酶結合的位點是固定的，酶量過多，酶分子相互擁擠，空間位阻增大，底物與產物不能及時擴散，酶活的回收率迅速降低.為得到活性較高的固定化酶，同時，考慮酶活性的回收率，適宜的酶溶液質量濃度為1 g/L.

2.1.3 固定化時間

分別將活化膜在1 g/L的酶液中固定0.5、1、2、3、4及5 h，其他條件不變，考察不同固定化時間對酶固定化的影響，結果如圖4所示.固定3 h內，隨固定化時間的延長，固定化酶的酶活和回收率迅速上升，進一步延長固定時間，固定化酶酶活和酶活回收率均急速下降.這可能由于固定化時間過長，微孔膜能與酶結合的位點達到飽和，無法結合更多的過氧化物酶，同時過多的酶使空間位阻也增大;另外，游離酶在緩沖溶液中過久易導致變性失活，從而使酶活和回收率下降.故適宜的固定化時間為3 h.

圖4 固定化時間對酶固定化的影響Fig.4 The influence of immobilizing time on HRP activity

2.2 HRP固定化酶催化氧化苯酚性能

2.2.1 固定化酶用量

以苯酚去除率為目標考察HRP固定化酶催化性能.固定化酶的使用量是苯酚去除率至關重要的影響因素之一.分別取不同質量的固定化HRP催化氧化質量濃度為500 mg/L的苯酚溶液，其中固定化酶在固定化各因素最佳條件下制得，實驗取苯酚與H2O2的摩爾比為1∶1，反應時間2 h.實驗結果如圖5所示.

圖5 固定化酶用量對苯酚去除率的影響Fig.5 The influence of immobilized HRP dosage on phenol removal

圖5中，當固定化酶用量為5 g/g時，苯酚去除率是46%，增加固定化酶用量到10 g/g時，苯酚去除率明顯增加達到65%左右，繼續增加固定化酶用量后，去除率達70%以上，此時去除率的變化趨于平緩.這是因為當酶量較高時，反應產物會與原酶結合占據酶的活性中心，產生反饋抑制現象，從而使部分酶失活［12］.綜上，1 g苯酚適宜的固定化酶用量為15 g.

2.2.2 酶催化氧化時間

取0.3 g固定化HRP，其他條件與2.2.1相同，考察反應時間對苯酚去除率的影響，從開始加入H2O2時開始記時，結果如圖6所示.當加入H2O2時，反應體系顏色立即變為黃色，隨反應時間的延長，溶液顏色由黃棕色向棕色、黑色變化，此時苯酚逐漸形成聚合物以固態出現在溶液中.不加H2O2或固定HRP都觀察不到溶液顏色的變化.從圖6可看出，在反應開始的50 min內，固定化酶催化苯酚的速度非常快，苯酚去除率明顯增加，大于50 min后，由于反應體系中苯酚、雙氧水的減少和酶的失活，反應趨于緩慢，表明此時反應已達到平衡，延長反應時間對反應平衡影響不大，故取50 min為最佳反應時間.

圖6 反應時間對苯酚去除率的影響Fig.6 The influence of reaction time on phenol removal

2.2.3 H2O2的用量

H2O2用量對苯酚去除率存在影響.取苯酚溶液初始質量濃度500 mg/L，其他條件取最佳反應條件，結果見圖7.由于殘留雙氧水的存在會影響苯酚質量濃度的分析，反應后所有樣品都加入少量MnO2，以使過量的雙氧水分解.由圖7可知，當苯酚去除率達76%左右時，H2O2與苯酚的摩爾比為3∶2，此時H2O2用量為1.237 5 mL.當H2O2與苯酚的摩爾比小于3∶2時，苯酚去除率隨著H2O2量的增加明顯提高;H2O2與苯酚的摩爾比大于3∶2時，隨雙氧水量的增加，苯酚去除率呈下降趨勢.這是由于固定化酶催化酚類物質的聚合是依靠活性中心鐵離子價態的變化來傳遞電子，當H2O2的用量超過一定值時，因雙氧水的氧化作用使部分鐵離子被氧化成高價態，從而失去催化功能［13］.綜上，實驗得到的H2O2與苯酚的最佳摩爾比為3∶2.

圖7 雙氧水用量對苯酚去除率的影響Fig.7 The influence of hydrogen peroxide dosage on phenol removal

2.2.4 苯酚溶液質量濃度

工業中含酚水的質量濃度一般從微量到幾百毫克每升都有，質量濃度分布較寬，為考察不同初始質量濃度的苯酚溶液對固定化酶催化性能的影響，取一定量的固定化酶用于不同初始質量濃度苯酚溶液的催化氧化實驗，其他條件為以上各因素最佳條件，為達到盡量好的去除效果，反應時間取2 h，結果如圖8所示.

圖8 苯酚溶液初始質量濃度對苯酚去除率的影響Fig.8 The influence of initial phenol concentration on phenol removal

2.2.5 HRP固定化酶的循環使用性

與溶液酶相比，固定化酶可以循環使用.以0.3 g的HRP固定化酶，處理40 mL，質量濃度為500 mg/L的苯酚溶液，每次反應后把固定化酶用蒸餾水沖洗，立即用于下次重復實驗，其他條件均為上述討論最佳條件，結果如圖9所示.從圖9可以看出，隨著固定化HRP循環使用次數的增加，其對苯酚的去除率迅速下降，2次使用后苯酚的去除率與第1次相比降低了60%左右，循環使用3次后，固定化HRP對苯酚的去除率降為4.26%，說明固定化酶在催化過程中存在失活現象.

圖9 固定化HRP酶循環使用結果Fig.9 The result of recycle for immobilized HRP enzyme

HRP失活是多種因素的影響，文獻報道稱主要有3個因素:一是HRP在催化循環中生成沒有活性的惰性中間產物［14］，二是催化反應中生成的酚氧自由基進攻酶的活性中心，從而導致HRP失活［15］，三是在催化反應中生成的聚合產物沉積在固定化酶上，包裹了酶的活性中心［16］.徐莉等［17］在對酶的固定化方法介紹中認為，共價結合法，其酶與載體間連接牢固，即使用高濃度底物或離子強度的溶液進行反應，也不會導致酶和載體的分離，因此循環使用中HRP的失活是HRP自身活性降低所導致的失活，而不是HRP與微孔膜分離后流失所致.此外，程俊、于少明等［18］認為在反應液中加入助劑，如聚乙二醇等，能有效地防止酚氧自由基對酶活性中心的攻擊和聚合產物對酶的包裹，它們對產物的親和性大于酶對產物的親和性，產物優先與助劑結合，大大減緩HRP的失活速率，延緩酶的使用周期.本文在考察HRP固定化酶的循環使用性時未添加任何的保護助劑，使固定化酶在循環使用中失活較嚴重.綜上，HRP的失活應該主要是上述二和三的綜合作用.

3 結論

以聚苯乙烯蜂窩狀微孔膜為載體，碳二亞胺為活化劑制備固定化HRP，HRP固定化適宜酶溶液質量濃度為1 g/L，固定化時間3 h.HRP固定化酶催化氧化苯酚表明，HRP固定化酶在較寬的底物濃度范圍內對苯酚有較好的催化效果，苯酚質量濃度在200～600 mg/L范圍內都有較高的去除率，適宜固定化酶用量為15 g/g，最佳反應時間為50 min，H2O2與苯酚的最佳摩爾比為3∶2，在此條件下苯酚的去除率在76%左右.HRP固定化酶可循環使用3次，3次后其對苯酚的去除率降為4.26%.聚苯乙烯微孔膜固定化HRP的使用效果還有待于進一步提高.

［1］ 于少明，程俊，左鵬，等.以層柱黏土為載體固定辣根過氧化物酶［J］.化工學報，2006，57(12): 3021－3024.

［2］ 王杉霖，張劍波，王維敬，等.四氧化三鐵吸附包埋固定辣根過氧化物酶及其應用［J］.北京大學學報:自然科學版，2006，42(6):762－766.

［3］ 張國平，Nicell J A，鄒永廖.用辣根過氧化物酶處理廢水中的五氯酚［J］.環境科學研究，2000，13 (2):12－14.

［4］ Mohan S V，Prasad K K，Rao N C，et al.Acid Azo Dye Degradation by Free and Immobilized Horseradish Peroxidase(HRP)Catalyzed Process［J］.Chemosphere，2005，58(8):1097－1105.

［5］ Wu Y，Taylor K E，Biswas N，et al.Kinetic Model for Removal of Phenol by Horseradish Peroxidase with PEG［J］.Journal of Environmental Engineering，1999，125(5):451－458.

［6］ 洪偉杰，張朝暉，蘆國營.辣根過氧化物酶固定化新進展［J］.現代食品科技，2006，22(1):177－180.

［7］ 左鵬，于少明，楊杰茄，等.辣根過氧化物酶固定化載體材料的研究進展［J］.材料導報，2007，21 (11):46－49.

［8］ 施特爾馬赫B.酶的測定方法［M］.北京:中國輕工業出版社，1992:276－278.

［9］ Wu Y，Taylor K E，Biswas N，et al.A Model for the Protective Effect of Additives on the Activity of Horseradish Peroxidase in the Removal of Phenol［J］.Enzyme and Microbial Technology，1998，22 (5):315－322.

［10］Zhang Y，Wang C.Micropatterning of Proteins on 3D Porous Polymer Film Fabricated by Using the Breath Figure Method［J］.Advanced Materials，2007，19(7):913－916.

［11］Aksoy S，Tumturk H，Hasirci N.Stability of α-amylase Immobilized on Poly(methyl methacrylate-acrylic acid)Microspheres［J］.Journal of Biotechnology，1998，60(1/2):37－46.

［12］馬秀玲，陳盛，黃麗梅，等.磁性固定化酶處理含廢水的研究［J］.廣州化學，2003，28(1):17－22.

［13］Henriksen A，Smith A T，Gajhede M.The Structures of the Horseradish Peroxidase C-ferulic Acid Complex and the Ternary Complex with Cyanide Suggest How Peroxidases Oxidize Small Phenolic Substrates［J］.Journal of Biological Chemistry，1999，274 (49):35005－35011.

［14］Baynton K J，Bewtra J K，Biswas N，et al.Inactivation of Horseradish Peroxidase by Phenol and Hydrogen Peroxide:a Kinetic Investigation［J］.Biochimicaet Biophysica Acta(BBA):Protein Structure and Molecular Enzymology，1994，1206(2):272－278.

［15］Huang Q，Pinto R A，Griebenow K，et al.Inactivation of Horseradish Peroxidase by Phenoxyl Radical Attack［J］.Journal of the American Chemical Society，2005，127(5):1431－1437.

［16］ Nicell J，Bewtra J，Taylor K，et al.Enzyme Catalyzed Polymerization and Precipitation of Aromatic Compounds from Wastewater［J］.Water Science and Technology，1992，25(3):157－164.

［17］徐莉，侯紅萍.酶的固定化方法的研究進展［J］.釀酒科技，2010(1):86－94.

［18］程俊.層柱粘土固定辣根過氧化物酶及其在含酚廢水中的應用［D］.合肥:合肥工業大學，2006.