骨壞死實驗動物模型研究進展

范 猛，彭 江，盧世璧

1天津市第一中心醫院骨科，天津300192

2中國人民解放軍總醫院全軍骨科研究所，北京100853

骨壞死是一種常見病，主要累及股骨頭，當累及股骨頭時稱為股骨頭壞死，又稱股骨頭無菌性壞死及缺血性壞死。幼兒的股骨頭骨骼尚未發育成熟，表現與成人不同，稱為Perthes病 (Legg-Calve-Perthes disease，LCPD)。股骨頭壞死通常發生在中青年患者，如果不進行治療，骨壞死通常會進展到股骨頭塌陷并繼發骨性關節炎［1-2］。已經有多種治療方法挽救股骨頭免于塌陷，包括減輕壞死修復區的力學負荷，如限制負重、旋轉截骨等;增強壞死區的修復，如髓心減壓、電磁治療、骨移植等［3］。但是由于塌陷前治療的效果不夠滿意以及骨壞死患者人工關節置換相對較高的失敗率，目前迫切需要具有更好療效的治療方法來阻止股骨頭的塌陷［4］。出現這個難題的部分原因就是缺少一個能夠模擬人類股骨頭壞死全病程，尤其是進展到與人類類似的股骨頭塌陷的動物模型來進行不同治療方法的比較和驗證［5］。雖然有多種方法可以建立早期股骨頭壞死的動物模型［6-7］，但是很難建立一個從早期的影像和組織學改變到晚期的股骨頭塌陷表現都與人類相似的動物模型［3］。

為了用于檢驗不同治療方法的療效以及研究骨壞死的機制，理想的動物模型應該易于造模成功，具有良好一致性，并能夠模仿股骨頭壞死的全病程，具有較高的塌陷率并伴有壞死區附近的修復反應。理想的實驗動物應該是骨骼發育成熟，具有與人類類似的髖部結構及力學特性。本文將骨壞死分為創傷性骨壞死及非創傷性骨壞死，分別回顧其不同的造模方法，為將來骨壞死研究的實驗動物模型的選擇以及建立更好的動物模型提供參考。

創傷性骨壞死動物模型

手術方式破壞血運建立的股骨頭壞死動物模型臨床上由創傷造成的骨壞死就是由于股骨頭的血運受到破壞［8］。Nishino等［9］使用成年狗，通過術中髖關節臨時脫位并結扎旋股內側及外側動靜脈來造模;術后2周及4周通過核磁檢查發現壞死區，但是這種方法只建立了早期的骨壞死，這也與觀察時間較短有關。Hofstaetter等［10］使用成年的兔來造模，手術切除髖關節囊，環形損傷股骨頸的骨膜并結扎圓韌帶，向股骨頸鉆孔到達髓腔，破壞髓內血供以減少股骨頭血運。該研究使用顯微CT(micro-CT)和組織學的方法進行評價，術后6個月時沒有發現塌陷，術后12個月時15只動物中有2只 (13.3%)出現了股骨頭塌陷。但筆者在已塌陷標本的micro-CT圖像上只發現了軟骨下骨的骨折，并沒有發現股骨頭形狀的明顯改變，而且此方法造模所需的12個月的觀察時間有些過長。

Levin 等［11］、Peled 等［12］和其他一些學者［13-16］使用大鼠建立骨壞死的動物模型。造模方法都是手術將髖關節臨時脫位，切斷圓韌帶，環形切除股骨頸近端寬度達1 mm的骨膜及部分關節囊。Levin等［11］在術后42 d觀察到骨壞死存在，伴有新骨的形成，但沒有進展到股骨頭塌陷。因為大鼠的骨骼終生都在生長 (骺板未閉)，所以大鼠的骨壞死模型屬LCPD模型。雖然采用了相同的動物和造模方法，Peled等［12］在術后42 d發現股骨頭有變形，但組織學檢查并沒有明顯的骨壞死表現。筆者認為此模型中股骨頭的變形可能是因為手術創傷造成的髖關節不穩定，從而產生骨質疏松和骨性關節炎，類似的情況在Bejar等［17］的研究中也有報道。

一個經常被用作骨壞死研究的通過手術方式破壞血運的動物模型是小豬模型［18-21］，該模型通過用線在股骨頸部緊密結扎并切斷圓韌帶的方法來造模。Hofstaetter等［21］進行了大體、放射、顯微和電鏡檢查，發現了與LCPD類似的改變，如骨骺部在缺血4周后的發育遲滯和在缺血8周后的明顯扁平。該模型可用于研究LCPD的機制以及防治措施。

Swiontkowski等［22］使用手術造成豬股骨頸骨折并進行內固定的方式建立了骨壞死的動物模型，這種方法模仿了臨床上常見的股骨頸骨折后出現骨壞死的過程。組織學檢查發現所有的股骨頭都存在一定程度的骨壞死并伴有骨小梁微結構的改變，骨髓內脂肪和血管新生增加，其中部分骨壞死嚴重的動物在術后8周進展到了股骨頭塌陷 (共10只動物，其中5只骨骺閉合，5只骨骺未閉，其中7只出現股骨頭塌陷)。幾年后，Seiler等［23］使用了同樣的造模方法，在12只骨骼發育成熟的小型豬上重復了實驗，但結果很不相同，在術后8周僅發現1只動物出現了軟骨的外觀改變和早期的塌陷表現。因此筆者認為這種造模方法存在重復性較差的問題。

物理方式損傷建立的骨壞死模型冷和熱的損傷可以造成骨壞死的觀點逐漸被越來越多的學者接受。雖然這種物理損傷方式不會見于臨床，但是因為損傷后的表現與人類骨壞死后的表現類似，這種造模方法仍然很有應用價值［3，24-26］。在冷凍手術中，冷凍可以造成細胞和血管的直接損傷;而在持續的溫度為43℃至45℃的熱損傷時，也會造成細胞的死亡［27］。

Malizos等［28］使用冷凍和剝離股骨頸及粗隆間附著軟組織的方法建立狗的骨壞死模型，成功造成骨壞死并引發修復反應，但沒有進展到股骨頭塌陷。Conzemius等［3］以冷凍的方式成功建立了鴯鹋 (澳洲鴕鳥)的股骨頭壞死模型。通過沿股骨頸向股骨頭內鉆孔后使用液氮對骨小梁進行直接冷凍，并結扎股骨頸周圍血管，成功造成骨壞死并進展到了與人類類似的股骨頭塌陷，19只跛行動物中有13只出現股骨頭塌陷，但也有4只動物出現股骨頭下骨折。鴯鹋是一種雙足動物，而且身高體重與人類接近，尤其是其髖關節的生物力學特性與人類類似［5，29］。因此鴯鹋的骨壞死模型可能是目前可以用于評價股骨頭壞死治療的最佳動物模型。然而Conzemius等的模型仍然存在著不足，包括較高的股骨頭下骨折發生率、股骨頭周圍軟組織的損傷以及過大的壞死區［3，24］。隨后該研究組又采用了一種閉合回路的液氮循環冷凍裝置，除避免了周圍軟組織的冷凍損傷，還可以避免原有方法中由于股骨頭內通道結冰而阻礙液氮的進入［24］。這個裝置可成功控制壞死區的位置，并造成股骨頭內的部分性壞死，但可惜未見有塌陷的報道。Velez等［30］在羊身上使用類似的冷凍裝置進行骨壞死造模，組織學檢查確認造成了骨壞死，但是也沒有進展到股骨頭塌陷。不過這兩種模型仍然可以作為股骨頭壞死臨床前期的動物模型。

Li等［26］使用微波加熱的方法建立了兔的股骨頭壞死動物模型，術后短期內就實現了較高的塌陷率(術后12周出現69%的股骨頭塌陷)。股骨頭在55℃條件下加熱10 min，X線檢查可見損傷區出現密度減低和囊性變，術后4周和8周的組織學檢查確認了骨壞死和修復反應同時存在。但組織學結果顯示軟骨也出現了損傷，而且股骨頭的塌陷表現為影像學上的扁平伴有髖臼的軟骨下骨明顯減少，筆者認為與人類股骨頭壞死早期軟骨無損傷不同，微波對軟骨也造成了損傷，從而引發髖關節的骨性關節炎，而股骨頭的變形至少有部分是源于髖關節的骨性關節炎。

許多報道都顯示射頻損傷可以造成骨壞死［31-35］。Martel等［31］在狗的長骨上進行經皮射頻消融，在骨小梁上發現了骨壞死和修復反應，而且沒有皮質骨和關節軟骨的損傷。由此可見，射頻損傷可以作為一種建立股骨頭壞死的有效方法。

化學方式損傷建立的骨壞死模型Manggold等［36］通過向羊的股骨頭內直接注射無水乙醇的方法建立股骨頭壞死動物模型。術后12周在所有存活動物的股骨頭內都發現了骨壞死的表現，關節軟骨及股骨頭周圍血運未受影響，也未進展到股骨頭塌陷。10只動物中有1只動物因術中肺栓塞死亡，1只在術后6周出現股骨頭頭下骨折。這個模型具有較高的骨壞死發生率，但僅是早期的骨壞死表現，且并發癥發生率也較高。

非創傷性骨壞死動物模型

自發性骨壞死模型自發性高血壓大鼠經常可以出現骨壞死［37-40］。Hirano等［41］認為自發性高血壓大鼠發生的骨壞死是由于骺軟骨和骺板的異常以及繼發的軟骨骨化異常所致。Mihara等［42］發現當這些大鼠被放在強迫站位進食的籠內，骨壞死的發生率會明顯提高，這提示髖關節的負重會增加骨壞死的發生率。由于大鼠的骨骺終生不閉，這個模型也是LCPD 模型［43］。

激素性骨壞死模型糖皮質激素是骨壞死發生的一個關鍵危險因素［44］，許多學者給予兔注射甲基強的松龍 (methylprednisolone，MPS)來建立激素性骨壞死模型。Iwakiri等［45］給予兔 1次 20 mg/kg MPS，3周后在股骨近側干骺端有83%的骨壞死發生率。Kuribayashi等［46］使用了同樣的造模方法，4周后骨壞死發生率為70%，但有20%的動物給藥后死亡。Takao等［47］采取同樣方法，但結果只發現了近側干骺端和骨干內的骨髓壞死，給藥后1、3、6和9周均未發現骨壞死。由于不同學者使用同一模型的結果具有明顯差異，筆者認為這個模型的重復性較差。Wang 等［48］和 Ichiseki等［49］采用單次給予兔4 mg/kg MPS的方法造模，但將存在骨壞死定義為發現髓內造血細胞的壞死，或空骨陷窩，或任意一側的股骨出現骨細胞核固縮。筆者認為這個標準過于寬松，因為絕大多數學者都將存在骨壞死定義為在骨小梁廣泛存在的空骨陷窩或骨細胞核固縮，伴隨有臨近骨髓細胞的壞死［50］，所以以上兩種模型關于骨壞死發生率的數據在某種程度上而言是需要斟酌的。Kabata等［51］分別給予兔 4 mg/kg MPS 1次、2次、4次和8次，給藥后1周發現骨壞死集中在干骺端的中間側和骨干，對應的骨壞死發生率分別為47%、60%、73%和67%;在股骨近端的壞死灶的大小和數量沒有組間差異。在兔的激素性骨壞死模型中，骨壞死的病灶不會集中在股骨頭，而且只有早期的骨壞死表現，這些模型不是理想的骨壞死實驗動物模型。

Han等［52］使用大鼠建立激素性骨壞死模型，每天皮下注射21 mg/kg MPS并持續4周，骨壞死的發生率為80%。但是也采用了比較寬松的骨壞死定義，只要發現骨髓細胞壞死，即使骨小梁的骨細胞仍然存活也認為存在骨壞死。

Yang等［53］首次建立了小鼠的骨壞死模型，造模方法為口服地塞米松，并比較了連續給藥及間斷給藥的差異，發現給藥12周后骨壞死的發生率在間斷給藥組明顯低于持續給藥組 (8%比45%)，與臨床觀察到的現象類似。但是這個模型只在股骨遠端發現骨壞死的病灶，而且僅是早期的骨壞死，壞死率也較低。

Cui等［54］通過每周肌肉注射 3 mg/kg MPS建立了雞的骨壞死模型，24周后在12只動物中有4只出現了軟骨下骨的壞死和吸收、脂肪細胞增生以及新骨形成;但是在實驗過程中有48%的動物死亡。較低的壞死率和較高的死亡率，使得這個兩足動物模型看起來不如四足的兔模型好，不過這是首次成功使用兩足動物建立骨壞死動物模型。

脂多糖導致的骨壞死模型Irisa等［55］通過給兔靜脈注射單次低劑量的脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)引發的Shwartzman反應建立骨壞死動物模型，并在術后4周造成77%的動物出現多處骨壞死病灶，但35只兔中有4只注射藥物后死亡，壞死區附近的骨內小血管通常都可以發現存在栓子。雖然這個模型僅有9%的動物出現了股骨頭內的壞死灶，但是其復制了臨床上的血管炎性高凝的病理狀態，有利于骨壞死機制的研究。

免疫反應導致的骨壞死模型Tsuji等［56-57］建立了兔的血清病性骨壞死模型，造模方法為給兔經靜脈注射10 ml/kg無菌熱滅活的馬血清，共給藥2次，間隔為3周。病理過程與臨床上系統性紅斑狼瘡患者產生的免疫復合物沉積的病理過程類似。在給藥后72 h未發現骨壞死病灶，1周后骨壞死發生率高達86%，3周后又降至64%，但是僅有早期的骨壞死而且未出現在股骨頭部位。

激素和其他非創傷因素聯合應用建立的骨壞死動物模型

激素和LPS聯合應用建立的骨壞死實驗動物模型:Yamamoto等［58］首先應用糖皮質激素聯合LPS來建立兔的骨壞死模型，并與單獨應用LPS或激素進行比較。結果顯示與單用糖皮質激素或LPS相比，聯合應用組具有明顯高的骨壞死發生率 (85%)和更廣泛的骨壞死病灶分布，但是實驗動物死亡率高達50%。目前許多學者使用Qin等［59］的方法建立兔激素相關性骨壞死模型來進行骨壞死的研究［60-63］，造模方法為給予靜脈注射1次低劑量的LPS(10 μg/kg)后以24 h為間隔給予肌肉注射3次高劑量的MPS(20 mg/kg)。給藥后6周，93%的實驗動物出現骨壞死，25%的病灶分布在近端骨骺區，而且沒有實驗動物死亡。這個模型具有很高的骨壞死發生率，且實驗動物死亡率為零，是目前很好的激素相關性骨壞死模型。Wu等［64］也報道了MPS和LPS聯合應用建立兔的骨壞死模型，相較更早報道的Qin等［59］的模型，增加了1次低劑量LPS(10 μg/kg)，但結果相對略差:骨壞死發生率為90%，死亡率為6.2%。更晚一些，Guan等［65］也報道了激素和 LPS聯合應用建立兔的骨壞死模型，并與單獨應用激素比較獲得了稍高的骨壞死發生率 (股骨頭部:36.2%比30.0%)，造模方法為間隔24 h給予2次高劑量LPS(40 μg/kg)后給予1次醋酸氫化潑尼松龍(20 mg/kg)，沒有實驗動物死亡。但根據Kawamoto等［66］的報道，當 LPS的劑量超過 15 μg/kg會有較高的動物死亡率，但此研究中為零;且單獨給予激素時股骨頭部高達30%的骨壞死發生率也遠遠高于以往報道的其他類似研究［45-47］，所以筆者認為這個研究的結果很可能是難以重復的。Okazaki等［67］使用大鼠間隔24 h給予2次靜脈注射2 mg/kg LPS和3次肌肉注射20 mg/kg MPS來建立骨壞死模型，給藥完成后1、2、3和4周分批處死，發現股骨近端的骨壞死發生率分別為33%、33%、67%和33%，但該研究中每組只有3～4只動物，筆者認為難以將其數據直接與其他模型進行比較。

激素和馬血清聯合應用建立的骨壞死實驗動物模型:Matsui等［68］通過給予馬血清引發血管炎后再給予大劑量糖皮質激素建立兔的骨壞死動物模型，并與單獨應用馬血清及激素進行比較。組織學檢查發現聯用組20個標本中有14個 (70%)在股骨干部出現骨壞死表現，其中7個顯示為骨髓壞死，7個顯示為骨髓和骨小梁同時壞死，單獨應用馬血清或激素組都沒有發現骨壞死表現。此研究顯示聯合應用優于單獨應用任何一種，但將此研究結果與其他學者單獨應用激素造模的結果［45-56］進行比較，可以發現聯合應用似乎并不具優勢。后來，Wen等［69］也通過聯合給予2次馬血清和2次小劑量激素建立了兔的骨壞死模型，但并未提供骨壞死發生率的數據，所以無法與其他模型進行比較。根據以上結果，筆者認為目前還不能確定在產生骨壞死方面激素和馬血清聯合應用優于單獨應用激素。

酒精性骨壞死模型在亞洲，尤其在中國大量飲酒很常見，而這經常會導致股骨頭壞死［44］。Wang等［70］通過灌胃的方式每日給予小鼠46%的酒精，6個月后在股骨頭的軟骨下區發現了骨壞死。雖然僅是早期的骨壞死表現，但是也很好地復制了人類酒精性股骨頭壞死，可以用于酒精性骨壞死的研究。

減壓性骨壞死模型Chryssanthou［71］于1981年報道了小鼠的減壓性骨壞死模型，造模方法為將小鼠短時間置于高氣壓環境中，模仿人類的致病機制;2個月以后發現了骨壞死。Lehner等［72］于1997年建立了成年羊的減壓性骨壞死模型，7個月后發現長骨關節下區的骨壞死病灶，不過人類的減壓性骨壞死病灶多發生在骨干。

化學性骨壞死模型溶血及凝血異常的患者，如地中海貧血和鐮狀細胞病的患者會出現骨損傷［73］。2-丁氧基乙醇體內代謝后形成正丁氧基乙酸，會使血液產生類似的異常。Shabat等［73］報道了通過給予2-丁氧基乙醇建立兔的骨壞死模型，給藥24 d后，8只動物中有1只在股骨干出現了骨壞死改變。該模型雖然成功率很低，但有利于研究鐮狀細胞病及其他血紅蛋白疾病引發的骨壞死的機制。

激素聯合手術方式破壞血運建立的骨壞死動物模型

近來，Kuroda等［74］報道了一個新的兔的骨壞死動物模型，造模方法為給予1次大劑量肌肉注射MPS，然后通過電凝破壞股骨頭周圍血運，結果8周內出現骨壞死表現，12周時5只動物中有2只出現股骨頭塌陷，24周時所有標本都發現骨性關節炎的改變。這個結果優于單純進行手術方式血運破壞［10］或者單獨應用激素造模［45-47］。不過從該研究中已塌陷標本的micro-CT圖像上，僅能發現軟骨下骨的變形，并沒有典型的塌陷表現。而且其組織學圖像上可以發現修復反應表現為壞死骨邊緣的原位新骨形成，即限制性修復［59］，而非人類股骨頭塌陷通常表現的破壞性骨修復方式［75］。

問題與展望

近幾十年來，學者們一直在努力建立一個病因和發病機制以及壞死后表現都與人類相仿的骨壞死實驗動物模型。通過對文獻的回顧，筆者發現創傷性或者非創傷性的造模方法都沒有建立理想的骨壞死實驗動物模型，每個模型都有一定的缺陷。創傷性骨壞死模型的優勢在于可以控制骨壞死的位置，使其位于股骨頭部，而且可以建立晚期的骨壞死模型，尤其是鴯鹋冷凍骨壞死模型成功進展到了股骨頭塌陷，而且塌陷率較高。但除了略高的并發癥發生率和過大的骨壞死病灶，Conzemius等［3］的冷凍鴯鹋模型的致病因素也與人類發病因素不同;如果能使用鴯鹋建立非創傷性的塌陷的股骨頭壞死模型將更為理想。非創傷性動物模型具有與人類發病類似的病因，但是只能產生早期的骨壞死，而且骨壞死的病灶大多集中于骨干區而不是在股骨頭，提示可能具有不同的病理機制。同時使用激素和手術破壞血運的方式造模可以獲得比單一方式更高的骨壞死發生率，但是也使得其既不能很好地模仿人類的病因，又不能使病灶僅僅局限于股骨頭部。

與成年動物相比，小豬對手術破壞血運的反應更明顯，而且成功進展到了明顯的股骨頭扁平，是很好的LCPD動物模型，但同時需要明確幼兒的LCPD和成人的股骨頭壞死在病理機制、自然病程和治療方面均不同［76］。在未發育成熟的股骨頭上所觀察到的現象，并不能直接推廣應用到成年人的股骨頭上［21］。

與四足動物相比，兩足動物鴯鹋具有體型和髖關節生物力學特性與人類相似的優點［5，29］，因為壞死區所承載的力學負荷也會影響到股骨頭的塌陷［75］，兩足動物和四足動物之間的髖關節力學特性的差異可能是影響塌陷是否產生的關鍵因素。雞的激素性模型與其他四足動物相比并無優勢，這可能是因為禽類對于激素的反應不如哺乳類敏感。

由于目前還沒有一個理想的骨壞死動物模型，筆者在比較了不同模型的優勢和不足之后，根據研究目的的不同，對于模型的選擇提出如下建議:Hofstaetter等［21］使用手術破壞血運的方式建立的小豬骨壞死模型，在研究LCPD的機制和防治方面具有優勢;Qin等［59］給予兔1次低劑量的 LPS和3次高劑量的MPS建立的激素相關性骨壞死模型具有很高的骨壞死發生率，且病死率為零，適用于激素相關性骨壞死的研究;如果要驗證股骨頭壞死治療方法的有效性，則Conzemius等［3］建立的鴯鹋冷凍股骨頭壞死塌陷模型具有優勢。

綜上所述，近年來大量骨壞死實驗動物模型被用于骨壞死的研究，提高了對于骨壞死機制的認識，也改善了治療手段，但目前仍有大量的工作要做。目前可根據研究目的的不同來選擇不同的動物模型;而模仿臨床病因，多種方式聯合造模及使用兩足動物鴯鹋將是骨壞死實驗動物模型的發展方向。

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