小鼠海馬內HDAC2的表達及其與NMDA受體、PSD-95的共定位

姚志剛，張 玲，劉 羽，黃 瀾，馬春梅，許艷峰，盛樹力，秦 川

(北京協和醫學院比較醫學中心，中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

突觸后致密區(postsynaptic density，PSD)是指在電鏡下中樞神經系統內沿突觸后膜胞質面分布的一種均勻而致密的帶狀或盤狀結構。該結構厚約25～50nm，直徑約250～500nm［1］。最近的研究發現，人腦中的PSD含有1461種蛋白，包括膜神經遞質受體(NMDA受體、AMPA受體、mGlut受體等)、信號蛋白(CaMKII、SynGAP等)、支架蛋白(PSD-95、Homer、Shank等)、細胞骨架蛋白(tubulin等)、調節蛋白及修飾酶類(CaN、PKC、PKA等)等［2，3］。這些蛋白整合在一起形成的蛋白復合物有利于它們之間的相互作用和活性調節，使突觸后信號快速并特異性地向胞質和胞核傳遞以影響蛋白質合成、突觸可塑性調節和記憶形成。

組蛋白去乙酰化酶(HDACs)能夠介導組蛋白賴氨酸殘基去乙酰化，導致帶正電荷的賴氨酸殘基與帶負電荷的DNA分子之間的結合力增強、染色質發生固縮，使啟動子不易接近轉錄調控元件，從而抑制基因轉錄［4］。目前已知HDACs包含四大類18個亞型，其中I類中的HDAC2對突觸可塑性和學習記憶能力具有顯著的負調控作用，但具體的分子機制尚未闡明［5］。而且，有關 HDAC2在海馬部位的分布及其與PSD蛋白復合物是否存在相互作用的報道較少。本實驗對C57BL/6小鼠海馬內HDAC2的分布及其是否與多種PSD蛋白成員具有共表達關系進行形態學的觀察和研究，以期為進一步探討HDAC2與PSD蛋白復合物之間的內在聯系及在海馬相關的學習記憶過程中可能起到的調控作用提供形態學依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

3月齡健康雌性C57BL/6小鼠7只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，體重(20±2)g，合格證號為 SCXK(京)2009-0007。動物飼養于恒溫(25℃)動物房獨立通風系統(IVC-II型，蘇州市蘇杭科技器材有限公司)，光照14h，黑暗10h，自由飲水取食。小鼠脫臼處死后取全腦，入恒冷冰凍切片機(Leica CM l850，德國)行10μm連續冠狀面切片，隔3片取1片。切片于4%多聚甲醛溶液固定20m in，再在0.01mol/L PBS中放置30min，最后經純乙醇脫水2min，放入-20℃冰箱中保存備用。

1.2 實驗試劑

小鼠抗小鼠 HDAC2多克隆抗體及兔抗小鼠NMDA受體亞單位 1(NR1)多克隆抗體均購自Abcam有限公司，兔抗小鼠PSD-95多克隆抗體由首都醫科大學北京宣武醫院多肽合成室提供。超敏型抗小鼠二步法檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒、異硫氰熒光素(FITC)標記的山羊抗兔IgG、羅丹明(TRITC)標記的山羊抗小鼠IgG、含有DAPI的水溶性封片劑均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 免疫組化染色

HDAC2的組化染色按照試劑盒說明書步驟進行，HDAC2一抗稀釋比例為1∶50。圖像拍照及分析應用ProgRes CCD攝像頭及分析軟件。

1.4 免疫熒光雙標染色

冰凍切片經20%山羊血清室溫封閉20m in后直接滴加稀釋好的兩個一抗(不同種屬來源)，HDAC2、NR1、PSD-95的稀釋比例分別為1∶50、1∶100、1∶100，4℃過夜。次日0.01mol/L PBS洗滌后加入混合稀釋的熒光標記二抗(稀釋比例均為1∶100)，37℃水浴箱內孵育30min(注意避光)，0.01mol/L PBS充分洗滌后用含有DAPI(353nm波長激發產生藍色熒光)的水溶性封片劑封片。陰性對照分別用正常兔和小鼠血清代替一抗，其余與上述步驟相同。樣品利用激光共聚焦顯微鏡系統(Leica TCS-SP5)對免疫熒光染色切片進行分析和拍照，光源分別用488nm和550nm波長的激光器激發綠色和紅色熒光，掃描分辨率為1024×1024pixel，計算機數據采集，數字成像。

2 結果

2.1 海馬內HDAC2陽性神經元的分布

HDAC2免疫組化反應陽性細胞呈棕黃色，以胞核著色為主。在小鼠海馬CA1～CA3區錐體細胞層和齒狀回顆粒細胞層的神經元胞核內，HDAC2均有較高的表達量；在海馬始層、輻射層、腔隙-分子層、分子層和多形層散在分布著少量的HDAC2陽性細胞；而在海馬槽和海馬傘部位罕有HDAC2陽性著色細胞。

2.2 NR1、PSD-95陽性神經元在海馬內的分布

由FITC綠色熒光基團標記的NR1以胞膜著色為主，胞質淡染。陽性染色神經元主要集中在海馬CA1～CA3區錐體細胞及齒狀回(DG)顆粒細胞中，始層、輻射層、腔隙-分子層和多形層可見少量散在分布的陽性神經元(圖1)。PSD-95為胞質蛋白，FITC綠色熒光基團標記的陽性神經元主要分布于各區錐體細胞層和齒狀回顆粒細胞層，此外始層、輻射層、腔隙-分子層和多形層亦有散在表達(圖2)。但在海馬室床和海馬傘細胞中均少見有NR1、PSD-95陽性染色細胞分布(圖1，2見彩插1)。

2.3 HDAC2與NR1、PSD-95的共表達

拍照后的圖像疊加處理發現，如圖1和2所示，NR1、PSD-95染色陽性(綠色)的海馬CA1～CA3區錐體細胞層和齒狀回顆粒細胞層的神經元胞核均有HDAC2的表達(紅色)，且在CA1～CA3區始層、輻射層和腔隙-分子層亦可見少量散在分布的雙染神經元。此外，DAPI復染細胞核形成的藍色區域與紅色區域的重疊證實HDAC2主要表達于核內。

3 討論

海馬屬于邊緣系統，是人類和其他哺乳動物大腦的重要組成部分。大量的實驗資料和臨床觀察表明，海馬結構與空間和識別記憶密切相關［6］。C57BL/6小鼠常被認作是“標準”的近交系小鼠，可為許多基因工程動物提供遺傳背景。最近的研究顯示，C57BL/6小鼠海馬在3月齡后基本發育成熟［7］。因此，本實驗選取3月齡C57BL/6小鼠海馬作為研究NMDA受體、PSD-95、HDAC2表達及共定位的結構基礎。NMDA受體屬于親離子型谷氨酸受體，屬于突觸后致密區的組成成分之一。NMDA受體與谷氨酸結合，迫使NMDA受體離子孔道中的鎂離子斥出而打開NMDA受體孔道，Na+與Ca2+內流使突觸后神經元內Ca2+濃度升高，激活多種Ca2+依賴的信號轉導途徑，如 Ca2+/鈣調蛋白依賴的蛋白激酶II(CaMKII)，后者激活細胞核內轉錄因子誘導基因表達和突觸可塑性的改變。突觸可塑性能夠誘導新神經回路的建立，因此被認為是學習記憶的基本神經機制［8］。PSD-95是位于突觸后致密區的一種支架蛋白，屬于膜相關的鳥苷酸激酶家族。PSD-95能夠形成多聚體與NMDA受體亞單位相結合并錨定于突觸后的特定部位，并通過與NMDA受體信號通路中一系列相關蛋白結合將信號分子、調節分子和靶蛋白有機地整合于谷氨酸能突觸結構并形成信號復合體，影響突觸結構和功能可塑性［9］。研究表明，在海馬依賴的空間記憶形成過程中，NMDA受體亞單位NR1，NR2A和PSD-95可被招募至突觸膜表面，以增強突觸可塑性過程中突觸傳遞的效能［10］。并且PSD-95還有助于NMDA受體的簇集和錨定［11］。本實驗研究發現NMDA受體亞單位NR1和 PSD-95在7只成年小鼠海馬 CA1～CA3區錐體神經元和齒狀回顆粒神經元內均有廣泛分布，這與已有的報道相一致［12，13］，表明 PSD蛋白復合物在海馬依賴的學習和記憶過程中起著重要的作用。

近年來，染色質重塑對學習記憶的調控作用越來越成為研究的熱點［14］。本研究發現，HDAC2在7只小鼠海馬CA1～CA3區錐體細胞和齒狀回顆粒細胞核內均有豐富表達，且與NR1、PSD-95存在明顯共定位現象。Guan等［5］發現腦內 HDAC2過表達時，小鼠海馬神經元樹突棘密度降低、突觸形成減少、CA1區LTP形成障礙、空間記憶和工作記憶障礙。而HDAC2敲除或給予了HDACs抑制劑的小鼠則表現出了與上述相反的改變。這提示HDAC2對突觸可塑性和學習記憶具有負調控作用。最近的研究證實，正常小鼠經學習記憶行為訓練后海馬神經元內PSD-95、CaMKIIα、CREB等突觸可塑性相關基因啟動子區存在組蛋白H3和/或H4的乙酰化修飾現象［15，16］。因此，推測在 HDAC2過表達的小鼠模型中，這些突觸可塑性相關基因啟動子區組蛋白H3和/或H4的乙酰化水平下降引起相應蛋白表達減少并導致突觸可塑性障礙。相反，在 HDAC2敲除或給予HDACs抑制劑的小鼠腦中，升高的組蛋白乙酰化水平使PSD-95、CaMKIIα等突觸可塑性相關基因表達增加，最終促進突觸結構和功能的可塑性。而在野生型小鼠的學習記憶過程中，PSD蛋白活化介導的信號轉導途徑可能參與了對HDAC2活性的調節。如甲基化CpG結合蛋白2(MeCP2)可結合于基因啟動子區并募集REST、CoREST和HDAC2等形成復合物抑制基因的轉錄。由NMDA受體激活的信號通路可活化CaMKII，后者又可進入胞核誘導MeCP2磷酸化，導致轉錄抑制復合物不穩定性增加而解離，從而促發基因轉錄［17］。最近的研究發現，C57BL/6小鼠在16月齡時海馬組蛋白 H3和H4乙酰化水平顯著降低并且情景恐懼記憶存在缺陷，推測其HDACs(包括HDAC2)的表達和/或活性可能有所增高［18］。

目前有關HDAC2對學習記憶的調控機制尚有諸多問題需要深入研究，例如，HDAC2參與調控哪些突觸可塑性相關基因的表達以及HDAC2的上游信號轉導通路的識別。結合已有的文獻資料和我們的實驗結果，從形態學角度推測在學習和記憶過程中，PSD蛋白成員可能通過信號轉導影響核內HDAC2轉錄抑制復合物的裝配而促進突觸可塑性相關基因的表達，并且這一機制可能又反過來影響PSD蛋白成員的表達水平，最終導致突觸結構和功能的變化以調節學習記憶過程。本研究為探討染色質修飾在學習記憶中的調節作用提供了細胞學基礎，并為以C57BL/6小鼠為遺傳背景、具有認知障礙表現的轉基因動物的研究提供了形態學線索。

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