常用實驗動物肝癌模型研究進展

李曉娟，白云峰，崔 智，高 蓉，鮑龍濤，李瑞生

(1.解放軍第302醫院實驗技術研究保障中心，北京 100039；2.解放軍總醫院腫瘤內科，北京 100853)

我國是肝癌(HCC)發病率較高的國家之一，近20年來肝癌的病死率呈上升趨勢，已成為我國第2位惡性腫瘤［1］，也是世界范圍內死亡率最高的惡性腫瘤之一。肝癌是由病毒、化學致癌物等多病因作用，因癌基因或癌相關基因激活、抗癌基因失活或胚胎期某些酶基因重新復活等諸多因素引起肝細胞生長失控而致癌變，經啟動、促進和演變等多階段的發病過程，并與基因調控和表達密切相關［2］，由此可見肝癌的發生發展過程是多因素作用的結果，目前肝癌的致病機理尚未研究清楚，尚未尋找到有效的治療方法，因此深入闡明肝癌的致病機理對于研發新的藥物治療靶位和解決臨床治療難點具有十分重要的意義。大量的研究者應用常用的實驗動物如小鼠、大鼠、裸鼠、倉鼠、家兔、土撥鼠和豬等建立了許多優質的肝癌動物模型，這些模型的建立采用的方法各不相同，常見的有自發性肝癌模型、誘發性肝癌模型、移植性肝癌模型和轉基因肝癌模型等。這些動物模型從不同的角度揭示了肝癌的發病原因和致病機理，也為今后尋求有效診斷方法，提高人類肝癌的診治率提供了理論參考。下面就針對這些動物模型的研究進展情況進行探討和綜述。

1 小鼠

應用小鼠來復制動物模型是最經濟最理想的，目前小鼠肝癌動物模型主要包括化學誘導性、移植性、轉基因和裸小鼠肝癌動物模型?；瘜W誘導小鼠肝癌模型的特點是其發生過程類似于人肝癌發生的“損傷-纖維化-惡性轉化”周期變化，誘導劑包括：二乙基亞硝胺(DEN)、過氧化物酶體激增劑、四氯化碳、黃曲霉素(AFB)和硫代乙酰胺等，常規的誘導方法通常是將其中一種或幾種組合作用于小鼠建模，新生小鼠對AFB極敏感，而成年小鼠有一定耐受性［3］，通常誘導建模周期為4～6個月甚至一年。劉勇等［4］使用 DEN、部分肝切除(PH)和二乙?；?2-AAF)復合法建立小鼠原發性短期誘導模型，不僅能夠節約大量的人力物力時間，而且實驗效果很好。

移植性小鼠肝癌模型的優點是飼養方便，操作簡單，此模型適用于藥物篩選及較大規模的實驗性治療。目前常用的移植腫瘤包括H615肝癌(615系小鼠同基因型瘤株)和H22腫瘤株。H615肝癌模型是將H615肝癌瘤株植入615近交系小鼠腫瘤皮下、肌肉或腹腔內，此模型對化療藥物的敏感性與肝癌的臨床化療效果相近，可用作肝癌的基礎研究及藥效學研究以及不同治療方案的比較與探索［5］。H22腫瘤株屬于小鼠的肝細胞瘤(保持了上皮來源腫瘤的基本特征)，是將OAAT涂于C3H小鼠的皮膚100次后誘發，皮下傳代的肝臟實體瘤。此模型可廣泛應用于腫瘤基礎研究及藥物篩選，并且成為了公認的中醫藥研究抗腫瘤作用及機制的良好腫瘤模型［6］。

而目前最新應用的是轉基因小鼠肝癌模型，由于轉基因動物模型可按照研究需要進行設計和培育，其建立過程的本身就可進行疾病機制的研究，同時轉基因動物的發育過程是一個立體的實驗體系，不但能從動物整體的組織器官水平上進行研究，還可以深入到細胞水平和分子水平，為肝癌發病機制、藥物篩選和臨床醫學研究提供了理想的實驗體系。轉基因動物模型的實驗動物多選用CD1、C57BL/6×DBA、C57BL/6×SJL等品系小鼠，單基因和雙基因均可作為轉入動物體內的外源性基因，單基因如 HBx轉基因小鼠肝癌模型［7］、SV40轉基因小鼠肝癌模型［8］；雙基因如 TGFα與 c-myc雙轉入的轉基因小鼠肝癌模型［9］。轉入單基因建立的肝癌動物模型比轉入雙基因建立的動物模型成功率高，方法步驟簡單，但轉入雙基因建立的動物模型所需時間明顯縮短，有利于實驗研究。因此，利用轉基因技術建立肝癌動物模型為肝腫瘤的病因學研究開辟了一條新的研究領域。但轉基因肝癌動物模型也有制備的技術難度比較高，操作程序復雜，成本較高等不足之處。

裸小鼠肝癌動物模型是將人肝癌細胞株或肝癌組織塊直接移植到裸小鼠體內而建立的模型，屬于人鼠異種移植，也是最接近人的一種肝癌模型復制方法，移植部位根據實驗目的和實驗條件的不同可采用腹腔移植、皮下移植和肝內移植。移植方法有組織塊移植法、懸液移植法、組織勻漿移植法等?，F已建立了5株裸小鼠人肝癌組織模型LTNM 1～5和1株裸小鼠人肝癌細胞株模型LCNM1，均保留了原發性人肝癌形態及功能(分泌人甲胎蛋白)的特征。但大部分人裸小鼠異種移植性肝癌模型轉移率較低，孫昉憲等［10］經篩選建立的裸小鼠人肝癌高轉移模型LCI-D20是目前研究人肝癌轉移機理及抗轉移治療較為理想的高轉移模型，被廣泛用于人肝癌的基礎治療研究。

2 大鼠

大鼠由于其體型大于小鼠，便于操作，是復制肝癌動物模型最常用的實驗動物。目前主要以移植性和誘發性大鼠肝癌動物模型為主，而裸大鼠人肝癌模型仍在不斷探索研究中。

移植性大鼠肝癌模型具有動物飼養簡單、移植方法簡便、移植成功率高、腫瘤生長快、患鼠生存期短、腫瘤生物學特性穩定而均一(均為肝細胞癌及高濃度甲胎蛋白分泌)等優點［11］。種鼠主要以BERH-2移植性大鼠和Walker-256鼠肝癌肉瘤帶瘤大鼠為主。BERH-2移植成功率較高，適于肝癌的局部治療研究。而 Walker-256瘤株來源于大鼠自發性乳腺癌，具有部分肉瘤性質，能較好地模擬人肝癌的膨脹性和浸潤性生長方式。實驗動物多選用雄性W istar大鼠，該模型性質穩定、制作方法簡單，成功率高、周期短，自然生存時間為3～4周，已廣泛地應用于肝癌影像學診斷實驗及肝癌局部治療。

根據移植部位的不同分為：腹腔移植、皮下移植和肝內移植。①腹腔移植接種的肝癌主要生長在肝與胃之間呈巨塊狀，有時在肝臟表面及腸系膜處和膀胱附近有一連串小珠狀的半透明腫瘤結節，晚期可出現癌性腹水。其優點是移植成功率高，罕見自發消退，生存期短，缺點是腫瘤較深，位置不局限，形態不規則而不易觀察及測量。②皮下移植常因腫瘤淺在，局限，便于觀測而被采用。但最大的缺點是有較高的自發消退率。此種模型一般用于研究腫瘤自發消退機理。③肝內移植接種的腫瘤位于肝臟內部，呈圓形或橢圓形，膨脹性和浸潤性生長，腹水發生率高。其優點是腫瘤在肝臟中生長，與臨床肝癌病例基本相似，且實驗周期短，模型易于建立，是研究肝癌局部治療的良好模型［12］。

而誘發性大鼠肝癌模型是指用化學、物理或生物的致癌因素作用于動物而形成的肝癌。其中化學藥物誘導法最常用，常用的化學藥物有二乙基亞硝胺(DEN)、黃曲霉素 B1(AFB1)、二甲基偶氮苯(DAB)、乙酰氨基芴(AAF)等，其中 DEN和 AFB1更為常用［13］，常用的實驗動物為 W istar、SD大鼠。化學致癌物質誘發的肝癌模型操作簡單，是目前應用較廣泛的一種方法。其特點是接近于人類肝癌的發病特點和過程、起病隱匿、病程長，誘癌成功率較高，腫瘤多為彌漫結節型。但其誘導時間長，動物死亡率相對較高，且肝癌出現的時間、部位、病灶數等存在個體差異。由于此類模型誘發因素和條件可人為控制，因此多用于肝癌病因學、發生學、發病機制、遺傳及生物學特性的研究。①二乙基亞硝胺(DEN)誘發大鼠肝癌模型的特點是誘癌成功率高，主要以肝細胞癌為主。常用3-4月齡、體重小于250g的大鼠較容易誘發肝癌。Nakatani等［14］認為雄性比雌性形成癌前增生性結節的數目多，摘除睪丸的大鼠可明顯減少肝癌的發生。②黃曲霉素B1(AFB1)誘發大鼠肝癌模型誘癌周期常需要一年以上，目前多選用較大劑量AFB1誘癌，Guyonnet等［15］建立了單劑量 AFB1致大鼠肝癌的短期實驗模型，給藥途徑一般用AFB1添加在飼料中食用，也可以腹腔注射給藥，一般不用灌胃給藥。③二甲基氨基偶氮苯(DAB)誘發大鼠肝癌模型使用含有0.06% DAB的飼料喂大鼠，同時控制飼料中維生素 B2含量(不超過1.5～2mg/kg)，經4～6個月可誘發成功［16］。④乙酰氨基芴(AAF)誘發大鼠肝癌模型主要給成年大鼠含0.03%2AAF標準飼料，按2～3mg/d/只標準給予 2AAF，經 3～4個月可誘發成功［17］。

裸大鼠人肝癌模型同裸小鼠人肝癌模型相同，均為人鼠異種移植，也是最接近人的一種肝癌模型復制方法，但裸大鼠肝癌模型目前的文獻報道較少，沈艷等［18］建立了裸大鼠移植人肝癌模型并且與裸小鼠移植肝癌模型進行了比較，結果顯示，與裸小鼠肝癌模型相比其產瘤量大，供血量多，動物形體大，適于實施一些外科小手術，主要用于腫瘤生物學特性、陽性掃描及多種實驗性治療研究，是肝癌模型研究的新成果。

3 倉鼠

倉鼠(敘利亞金色倉鼠)在形態學、生物學以及免疫學等方面與人有相似之處，可用于制作人類多種疾病的整體動物模型。因此在大鼠、小鼠、裸鼠的研究基礎上，研究開發使用此種實驗動物建立肝癌模型，為肝癌的治療研究又提供了一個新的研究平臺。2009年毛庭枝等［19］在白紀剛等［20］應用倉鼠pGHAM-1細胞株建立倉鼠移植性胰腺癌模型的基礎上，又建立了倉鼠移植性肝癌模型，將pGHAM-1培養后接種于倉鼠皮下，成瘤后再接種于倉鼠肝臟，結果證實 pGHAM-1種植于肝臟的成瘤率達100%。此動物模型的優點具有原位成瘤率高、復制方法簡便易行，是研究肝癌發病機理的又一良好動物模型。

4 家兔

目前有關家兔肝癌動物模型的文獻報道較少，主要以鼠類模型居多，但各種鼠類模型也存在著許多不足之處，如不適合于外科手術操作及介入治療方面的研究。家兔肝癌動物模型目前研究報道較多的主要是兔VX2肝癌模型，兔VX2移植瘤來源于Shope乳頭狀病毒誘導的野兔皮膚鱗狀細胞癌，經數次傳代后而建立，可被接種至肝、腎、肺等器官制成多種移植瘤動物模型［21］。兔VX2肝癌模型制作按接種所使用的瘤株形態可分為瘤細胞懸液接種、瘤塊懸液接種、瘤組織小塊接種［22］。其中瘤組織小塊接種法成功率高，對瘤細胞消耗小，性質穩定。韓冰［23］等應用改良組織塊接種法將組織塊插入注射針頭中，以細胞懸液注射法的方式注入肝內。而移植方法以肝實質接種為主，以往多使用開腹手術進行腫瘤移植，而現多借助在超聲、CT等影像監視下經皮穿刺進行肝實質接種，此種方法操作更簡便，成瘤率更高，且未改變腫瘤的生長特性，同時對實驗動物手術創傷小，動物存活率高。這種模型的制作由于簡便易行，實驗周期短、成功率高、重復性好、模型性質穩定、同時具備高血供、易形成肺轉移而被廣泛地應用于肝癌的診斷及治療方面的研究。但此模型不能很好的模擬人肝癌形成過程和臨床特點，其病理形態學也存在許多差異，因此該動物模型的研究和應用相對較少。

5 土撥鼠

土撥鼠是對乙型肝炎病毒比較敏感的實驗動物，1978年summers等［24，25］發現土撥鼠具有很高的慢性肝炎發生率，其中23%在尸解時發現有肝細胞癌，并且分離到一種在基因體構造或生物學特性上與人類乙型肝炎病毒有高度相似性的病原體土撥鼠肝炎病毒(WHV)。土撥鼠感染該病毒后的病程和人類感染乙型肝炎病毒比較相似，會引起慢性肝炎和肝癌，但不同的是不會出現肝硬化現象。攜帶WHV的土撥鼠在3年內有近100%的幾率會演變呈肝細胞癌［26］，因此土撥鼠成為了研究人類乙型肝炎病毒復制、自然病史、致病機制及防治方法最好的動物模型之一，也是研究肝癌成因及治療很重要的動物模型［27］。但由于土撥鼠很容易感染乙型肝炎病毒，復制肝癌的時間需要2～3年，因此土撥鼠更多是應用于乙型肝炎病毒的模型建立，而不適合于短期肝癌模型建立的研究。

6 豬

由于大動物肝癌模型病變復雜，不容易重復，發病率低，而不常用于肝癌模型的復制。但是實驗豬肝與人肝在解剖結構上存在很多相似之處，研究人員采用2-乙酰氨基酸制備豬肝癌模型，小劑量多次給藥即可致癌變。因此，在肝癌病理結構變化的研究過程中也有一定的應用前景。目前介入治療、熱療等結合治療成為肝癌治療的重要手段，可以采用耐熱性好的實驗豬作為實驗動物模型來研究熱療治療的劑量，療程長短以及介入與熱療聯合治療組合等問題的探索［28］。

7 討論

復制理想的肝癌動物模型應具備以下特點：①腫瘤的形成過程與人類肝癌的自然發生過程相似，腫瘤生長在肝上，以單性為主；②肝癌細胞的病理形態與人的肝癌細胞相似；③血清AFP及腫瘤酶學檢測呈陽性；④動物模型穩定、易于復制、操作簡便、實驗周期短［29］。大量的研究者采用了不同實驗動物種群和不同方法力求建立符合以上標準的肝癌動物模型，雖然這些動物模型具備了一定的優越性，但也受到許多限制性因素的制約和其重復性差等不足之處。如人肝癌裸鼠模型是目前實驗中最能反應人類肝癌生物學特性的“活試管”，但裸小鼠飼養條件要求高，體形小，操作精細，無菌要求高，不適于作經肝動脈插管注射等藥物的靶向性研究。裸大鼠對異種腫瘤易于接受，但飼養較為困難，價格昂貴，至今不能廣泛地被推廣應用。

隨著對肝癌治療和基礎研究的日益深入，通過基因打靶技術結合體細胞克隆技術、核酸干擾技術等可以將離體培養、基因敲除或基因定點修飾后的動物體細胞轉變成動物個體，將很好地解決動物轉基因效率低和基因表達方面的問題，這些可能成為肝癌動物模型研究新的發展方向。2003年Kataoka實驗室采用基因打靶法成功建立了PLCε基因敲除小鼠，研究發現 PLCε是癌基因產物Ras及抑癌基因產物Rap的新效應蛋白［30］。Shuzo Ikuta等［31］進一步證明了TPA介導PLCε的活化而誘發炎癥，導致腫瘤的形成。本課題組擬采用化學誘癌法在PLCε-/-小鼠體內建立肝癌動物模型，對比PLCε-/-小鼠與 PLCε+/+小鼠肝臟的病理學改變、肝腫瘤及癌旁組織形態、腫瘤及癌旁細胞增殖情況及分子標記物的改變，分析 ras基因構造以及突變情況，以及PLCε在肝癌發生發展過程中的致病機理。因此，利用基因打靶技術可以建立更加符合人體肝癌多種生物學特性的動物模型，培育出符合實驗要求、與人類近緣、使其誘癌過程相似于人肝癌的發生過程，且誘癌率高，實驗重復性好，便于進行藥物干預和療效分析的新的動物模型，從而建立一種理想的基因敲除小鼠肝癌動物模型來詮釋人類肝癌的發病原因和致病機理。

［1］吳孟超.原發性肝癌的診斷和治療進展［J］.中華外科志，1998，36(9)：515-518.

［2］Thorgeirsson SS，Grisham JW.Molecular pathogenesis of human hepatocellular carcinoma［J］.Nat Genet，2002，31(4)：339 -346.

［3］Ressolinovitch SD，M ihailovich N，Wogan GN，et al.A flatoxin B1，a hepatocarcinogen in infant mouse［J］.Cancer Res，1972，32(11)：2289-2291.

［4］劉勇，賽巖，劉冬梅，等.小鼠原發性肝癌短期誘導模型的建立和評價［J］.軍事醫學，2011，35(3)：175-179.

［5］錢振超，劉金友，趙肅榮，等.我國第一株小鼠可移植性肝細胞性肝癌模型(H615)的建立［J］.醫學研究通訊，1982，(7)：28.

［6］Hirohashi S.Production of a-fetoprotein and normal serum proteins by xenotransplanted human hepatomas in relation to their growth and morphology［J］.Cancer Res，1979，39：1819.

［7］Yu DY，Moon HB，Son JK，et al.Incidence of hepatocellular carcinoma in transgenic mice expressing the hepatitis B virus X-protein［J］.J Hepatol，1999，31(1)：123-132.

［8］Gillet R，Cavard C，Grimber G，et al.Hepatic expression of SV40small-T antigen blocks the in vivo CD95-mediated apoptosis［J］.Biochem Biophys Res Commun，2001，284(2)：369 -376.

［9］Calvisi DF，Factor VM，Loi R.Activation of beta-catenin during hepatocarcinogenesis in transgenic mouse models：relationship to phenotype and tumor grade［J］.Cancer Res，2001，61(5)：2085-2091.

［10］湯釗猷，劉康達，薛瓊，等.裸小鼠原位移植建立人肝癌高轉移模型［J］.中華腫瘤雜志，1996，18(2)：109-112.

［11］徐玉音，陳莉.肝癌動物模型建立的方法［J］.臨床與實驗病理學雜志，2011，27(4)：405-408.

［12］胡衛，陳濤.鼠移植性肝癌模型研究進展［J］.河南腫瘤學雜志，2003，16(6)：463-466.

［13］吳細丕，主編.實驗動物與腫瘤的研究［M］.北京：中國醫藥科技出版社.2000：176.

［14］Nakatani T，Roy G，Fujimoto N，et al.Sex hormone dependency of diethylnitrosamine-induced liver tumors in mice and chemoprevention by leuprorelin［J］.Jpn J Cancer Res，200l，92(3)：249-256.

［15］Guyonnet D，Belloir C，Suschete M，et al.Mechanisms of protection against aflatoxin B(1)genotoxicity in rats treated by organosulfur compounds from garlic［J］.Carcinogenesis，2002，23(8)：1335-1341.

［16］Karmkar R，Banik S，Chatterjee M.Inhibitory effect of vitamin D3 on 3'-methyl-4-dimethyl-amino-azobenzene induced rat hepatocarcinogenesis：a study on antioxidant defense enzymes［J］.J Exp Ther Oncol，2002，2(4)：193-199.

［17］Hosaka K，Kawa S，Aoki Y，et al.Hepatocarcinogenesis inhibition by caffeine in ACL rats treated with 2-acetylaminofluorene［J］.Food Chem Tocicol，2001，39(6)：557 -561.

［18］沈艷，廖菁，周文江，等.比較兩種免疫缺陷動物人肝癌模型的腫瘤生物學特性［J］.上海交通大學學報(農業科學版)，2009，27(4)：335-340.

［19］毛庭枝，周巧靈，梁榮感，等.倉鼠胰腺癌細胞株移植性肝癌模型的建立及其生物學特性［J］.世界華人消化雜志，2009，17(18)：1827-1831.

［20］白紀剛，呂毅，王浩華.倉鼠胰腺癌原位模型的建立及生物學特性［J］.第四軍醫大學學報，2005，26，2216-2218.

［21］Lin WY，Chen J，Lin YC，et al.Implantation of VX2carcinoma into the liver of rabbit—A comparison of three direct-injection methods［J］.J VetMed Sci，2002，64(7)：649-652.

［22］楊亞汝，許小云，張貴祥，等.兔VX2肝癌模型的建立及超聲評價 ［J］.中國醫學影像技術，2003，19(12)：1603-1605.

［23］韓冰，丁義濤，王冬梅，等.兔VX2肝癌模型接種方法的改進與螺旋CT觀察［J］.醫學研究生學報，2009，22(2)：135-138.

［24］Gerin JL.Experimental WHV infection of woodchucks：An animal model of hepadnavirus-induced liver cancer. Jpn Soc Gastroenterol.1990，25：38-42.

［25］Summers J，Smolec JM and Snyder R.A virus similar to human hepatitis and hepatoma in woodchucks.Proc NatI Acad SCI USA，1978，75：4533-4537.

［26］Gerin JL，Cote PJ，Korba BE，et val..Hepadnavirus-induced liver cancer in woodchucks.Cancer Detection Prev，1989，14：227-229.

［27］Roggendor M，Tolle TK.The woodchucks：an animal model for hepatitis B virus infection in man.Intervirology，1995，38：100-112.

［28］羅京偉，徐國鎮，熊京紅，等.射頻熱療豬肝臟的實驗觀察及測溫可行性研究［J］.中華放射腫瘤學雜志，2003，12(1)：58-60.

［29］Okuda K.Hepatocellular carcinoma［J］.J Heoatol，2000，32(1)：225-237.

［30］Song C，Satoh T，Edamatsu H，et al.Differential roles of Ras and Rap1in growth factor-dependent activation of phospholipase C epsilon［J］.Oncogene，2002，21(53)：8105-8113.

［31］Ikuta S， Edamatsu， Kataoka T， et al.Crucial role of phospholipase Cε in skin inflammation induced by tumorpromoting phorbol ester［J］.Cancer Res，2008，68：64-72.