葫蘆素B抗腫瘤作用及其機制研究進展

張延亭，歐陽東云，何賢輝

(暨南大學生命科學技術學院組織移植與免疫實驗中心，廣東 廣州 510632)

葫蘆素B(cucurbitacin B)是從葫蘆科等植物中分離得到的一類四環三萜類化合物，是葫蘆素家族中含量最豐富的成員，具有廣泛的藥理活性。現代研究表明，葫蘆素B具有保護肝、消炎和抗腫瘤等多種生物學活性［1-3］。20世紀70～80年代，國內已研發出葫蘆素片(含葫蘆素B和葫蘆素E)用于肝炎和原發性肝癌的輔助治療［4］。近年來，國內外學者對葫蘆素B的抗腫瘤作用進行了較為系統的研究，發現葫蘆素B具有較強的抑制STAT3轉錄因子活化的作用，并認為其抗腫瘤活性與抑制STAT3轉錄因子的活化有關［3，5-9］。然而，也有不少研究報道，葫蘆素B的藥理活性與抑制STAT3轉錄因子的活化無關［10-12］。目前較多研究表明，葫蘆素B可導致肌動蛋白細胞骨架的快速破壞，這種作用與其抗腫瘤作用密切相關［12，14-17］。由此可見，葫蘆素 B抗腫瘤作用機制還存在爭議，待深入研究。

1 葫蘆素B的抗腫瘤作用

1.1 葫蘆素B的體外抗腫瘤作用

葫蘆素B對多種白血病和淋巴瘤細胞具有明顯抑制作用。葫蘆素 B對5種白血病細胞 CCRF-CEM，K562，MOLT-4，RPMI-8226和 SR 的 IC50值為 15.6 ～35.3 nmol·L-1，并可引起G2/M期阻滯和凋亡［17］。此外，葫蘆素B對人淋巴瘤U937細胞的 IC50值為9.2 nmol·L-1，與抗癌藥物喜樹堿相近［18］。Haritunians等［19］報道，葫蘆素B對多種白血病和淋巴瘤細胞生長具有抑制作用。這些研究表明，體外培養的血液系統腫瘤細胞對于葫蘆素B的作用具有較高的敏感性。

葫蘆素B對源自實體瘤的貼壁腫瘤細胞也表現出廣泛的抗腫瘤活性，其敏感性與白血病細胞相似。葫蘆素B對多種人乳腺癌細胞［16，20］、多形性膠質母細胞瘤細胞［14］、結腸癌SW480 細胞［12］、喉鱗狀細胞癌 Hep-2 細胞［3］、肝癌 BEL-7402和HepG2細胞［7，21］、胰腺癌細胞［8-9］和皮膚鱗癌細胞［22］等體外增殖具有濃度依賴性抑制作用，其IC50值為10-8～10-7mol·L-1，敏感性與血液系統腫瘤相似。此外，一些含葫蘆素 B 的植物提取物也具有廣泛的抗腫瘤作用［2，13，23］。值得注意的是，在葫蘆素B的作用下，這些腫瘤細胞往往快速發生細胞形態的變化，導致細胞周期阻滯于G2/M期，并可誘發多核細胞的形成和腫瘤細胞凋亡。上述研究結果提示，葫蘆素B作為一種潛在的細胞骨架靶向藥物，可通過破壞細胞骨架尤其是微絲的結構，導致細胞變形等現象的發生。

1.2 葫蘆素B的體內抗腫瘤作用

Wakimoto等［16］用乳腺癌動物模型研究發現，ip給予葫蘆素B 6周后，腫瘤體積較對照組縮小55%，器官和組織并未見明顯損傷。Thoennissen等［9］研究表明，葫蘆素B可明顯抑制胰腺癌生長(用藥組腫瘤體積較對照組減少69.2%)及限制腫瘤轉移，且小鼠未呈現體質量減輕等不良反應。Liu等［24］報道，葫蘆素B可顯著抑制喉鱗癌裸鼠移植瘤的生長。Chan等［21］研究表明，葫蘆素B亦可抑制人肝癌BEL-7402移植瘤的生長。Sun等［6］報道，葫蘆素B對人肺腺癌A549裸鼠移植瘤的抑制率為53.6%。上述研究表明，可耐受劑量的葫蘆素B具有抗腫瘤作用，提示該藥物具有潛在的抗腫瘤臨床應用價值。

2 葫蘆素B的抗腫瘤作用機制

2.1 葫蘆素B對細胞信號轉導通路的影響

腫瘤是一類細胞信號轉導失調的疾病，這也使得基于信號轉導的腫瘤靶向治療成為腫瘤研究領域的重要方向。目前，葫蘆素B抗腫瘤的相關研究多集中在STAT3轉錄因子和絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號轉導通路。

2.1.1 STAT3 信號轉導通路

研究發現，多種惡性腫瘤存在STAT3通路的活化，抑制STAT3通路可能會抑制腫瘤生長和引起腫瘤細胞凋亡，因此篩選STAT3的抑制劑正日益受到重視［25］。研究表明，葫蘆素B及其他葫蘆素家族成員可抑制腫瘤STAT3通路的活化［3，5-9］，如對多種腫瘤細胞，葫蘆素Ⅰ(JSI-124)10 μmol·L-1作用4 h后，均可在不影響STAT3蛋白水平情況下顯著降低STAT3的磷酸化［26］，提示抑制STAT3活化可能是葫蘆素抗腫瘤作用的重要機制。然而，最近一些研究并不支持這一觀點。有學者報道，高濃度葫蘆素B(50 μmol·L-1)可抑制K562細胞STAT3的磷酸化，而較低濃度葫蘆素B(5 μmol·L-1)對STAT3的磷酸化水平并無影響，但仍可抑制細胞生長［17］。葫蘆素E的作用也表現出類似的現象［18］。此外，目前公認的STAT3抑制劑葫蘆素Ⅰ對STAT3基因敲除的成纖維細胞和正常細胞生長的抑制作用相似，提示葫蘆素Ⅰ對細胞生長的抑制作用可能與抑制STAT3的活化無關［10］。據報道，葫蘆素B也不影響人肝癌 BEL-7402細胞 STAT3的磷酸化水平［21］。Tannin-Spitz等［13］發現，葫蘆素B/E糖苷可引起乳腺癌細胞STAT3的活化。值得關注的是，葫蘆素B對STAT3信號通路的影響晚于細胞形態和其他一些信號通路的變化［17］。可見，葫蘆素B對STAT3活化的影響因細胞和藥物濃度而異，其抗腫瘤活性可能涉及其他更為上游的作用靶點。

2.1.2 MAPK 信號轉導通路

MAPK信號轉導通路控制細胞增殖、分化和凋亡等多種生理過程，在細胞信號網絡中起重要作用。已往研究表明，葫蘆素B對該信號轉導通路的影響因細胞而異。如葫蘆素B對腦瘤細胞細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)1/2磷酸化有抑制作用［14］，并在短時間內明顯抑制K562細胞中c-Raf、絲裂原活化蛋白和ERK1/2的磷酸化，其影響早于對STAT3的抑制［17］。然而，在人肝癌BEL-7402細胞中，葫蘆素B抑制c-Raf活化而促進ERK1/2的磷酸化，這種矛盾現象可能歸因于信號通路間的交聯［21］。此外，在人肺腺癌A549和喉鱗癌細胞中，葫蘆素B可引起ERK1/2的活化［3，6］。同樣，葫蘆素 B對 JNK的影響也有類似現象。在人肺腺癌A549細胞中，葫蘆素B用藥4 h后，可抑制JNK1的磷酸化，而在腦瘤細胞中葫蘆素B卻可誘導JNK，c-JUN和P38 MAPK的磷酸化，并且在抑制JNK活化后可減弱細胞形態的變化程度［14］，提示JNK/c-Jun信號轉導通路在葫蘆素B的抗腦瘤作用中可能發揮一定作用。因此，葫蘆素B對MAPK信號轉導通路的影響比較復雜，而且因細胞而異，其作用機制仍需進一步研究。

2.1.3 其他信號通路

葫蘆素B對磷酸肌醇-3激酶/磷酸酶及張力蛋白同源的基因蛋白/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)和NF-κB信號轉導通路的影響也有報道。葫蘆素B/E糖苷引起乳腺癌細胞PKB降低［13］，而在人肺腺癌A549細胞中葫蘆素B不影響PKB活化［6］。研究表明，ERK和mTOR可磷酸化S6激酶從而誘導缺氧誘導因子1α表達［27］;而在人肝癌Hep3B細胞，葫蘆素B可抑制缺氧誘導因子1α表達，其對NF-κB的抑制作用甚至超過已知 NF-κB抑制劑雷公藤紅素［29］。這些研究表明，葫蘆素B可能影響相當廣泛的細胞轉導通路。

2.2 葫蘆素B對細胞骨架的影響

葫蘆素可引起細胞形態的急劇改變［11，13-16，20］，提示影響細胞骨架是葫蘆素類藥物的共性。葫蘆素B可引起腦瘤細胞骨架發生快速而顯著的變化，并且對微絲的影響早于微管［13-14］。同樣，在乳腺癌細胞中，葫蘆素B可快速誘發微絲結構改變，隨后微管也受到影響［16］。此外，Haritunians等［19］研究表明，葫蘆素B可引起白血病細胞纖維狀肌動蛋白聚集，而微管基本未受影響。這些研究說明，葫蘆素B可先引起微絲結構的改變，隨后誘發微管結構的變化，提示肌動蛋白細胞骨架可能是其潛在的作用靶標。

微絲主要以球狀肌動蛋白和纖維狀肌動蛋白動態平衡形式存在。有研究表明，葫蘆素可引起纖維狀肌動蛋白的解聚，并導致肌動蛋白聚集［10-11，14-15，18-19，29-30］。Momma 等［31］研究報道，葫蘆素E可直接作用于微絲。Nakashima等［18］用生物素標記的葫蘆素E進行親和層析，發現葫蘆素E和葫蘆素Ⅰ均可濃度依賴性地抑制絲切蛋白的磷酸化。Escandell等［11］報道，葫蘆素B衍生物可誘導凝溶膠蛋白表達，其作用不依賴于P53。但是最近研究表明，葫蘆素Ⅰ與絲切蛋白和凝溶膠蛋白的化學修飾無關［30］。這些研究表明，葫蘆素類藥物可能是通過影響肌動蛋白細胞骨架的調控因子，破壞了肌動蛋白的動力學平衡，從而誘發肌動蛋白的異常聚集。

肌動蛋白聚合/去聚合狀態的改變與諸多細胞生理過程如胞質分裂、凋亡、運動和分泌等有關，一旦藥物影響到這種平衡，對細胞的影響是廣泛而深遠的。葫蘆素B引起的細胞形態和功能的改變，如信號轉導紊亂、細胞周期阻滯、細胞多核化、細胞運動喪失和細胞凋亡等，可能與微絲骨架的受損有關。有研究表明，肌動蛋白細胞骨架的破壞可抑制PKB的磷酸化，從而抑制存活素的表達［32］。葫蘆素B/E糖苷也可引起類似的改變［13］。葫蘆素B停藥后，細胞變形改善，增殖能力也明顯增強［10，14］。此外，據報道，葫蘆素作用后，細胞的運動能力幾乎完全喪失［30］。與葫蘆素相似，其他抗肌動蛋白的藥物如加斯諾利(jasplakinolide)和抗微管蛋白的藥物如長春新堿也能限制腫瘤細胞的運動［33］。綜上所述，葫蘆素B可能通過破壞肌動蛋白細胞骨架而發揮其抗腫瘤作用。

2.3 葫蘆素B對細胞周期的影響

周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinase，CDK)組成的蛋白激酶復合體推動細胞周期進程，如果遇到不利于細胞周期的刺激，細胞會利用各階段的細胞周期調控機制做出相應調整。抑制G1期的蛋白激酶復合體在G1/S期調控中發揮重要功能，如P21Waf1/Cip1可通過引起周期蛋白E-CDK2蛋白激酶復合體的失活，導致G1/S期阻滯;P21也可引起G2/M期阻滯［34］;而葫蘆素B可誘導腫瘤細胞P21 的表達［8，9，13］。P34CDC2蛋白激酶(CDK1)是真核細胞G2/M期的關鍵調控蛋白［32］。葫蘆素 B/E糖苷用藥1 h后P34CDC2表達下調，24 h后P34CDC2與周期蛋白B1的表達顯著減少［13］。此外，葫蘆素B能下調周期蛋白A，周期蛋白B1，周期蛋白 D1，P34CDC2和 CDC-2 的表達［3，9，21-22］。由此提示，葫蘆素B及其衍生物可能影響多種細胞周期調控蛋白的表達和功能。

需要注意的是，葫蘆素B停藥后，細胞形態逐步改善，增殖能力顯著增強，但是多數細胞變為大型多核細胞［9，14］，提示葫蘆素B對胞質分裂的影響較大，而對核分裂影響較小，而且對胞質分裂的影響不易修復。如果上述推論正確，那么多數研究中檢測到的G2/M期阻滯細胞，很可能是已進行完核分裂而胞質分裂無法繼續的四倍體細胞。鑒于已知影響微絲骨架的藥物都會導致不同程度的細胞周期阻滯，葫蘆素B引起的細胞周期阻滯很可能是微絲骨架受損的后果。

2.4 葫蘆素B誘導腫瘤細胞凋亡的機制

葫蘆素B誘導腫瘤細胞凋亡與Bcl-2家族、存活素、胱天蛋白酶家族、線粒體膜電位、P53和P21等因素有關。在多種腫瘤細胞中，葫蘆素B及其衍生物可抑制Bcl-2和存活素的表達［3，5，8-9，13］，激活胱天蛋白酶［8-9，12-13］以及導致線粒體的膜電位或通透性發生變化［3，5，13，35］。同時，葫蘆素 B 還可使 P21或 P53表達上調［8-9，13］。一方面，P53 可特異性地抑制Bcl-2的表達，促進Bax的表達，似乎有利于細胞凋亡;另一方面，P53誘導P21上調可提高細胞的存活率［36］。有研究顯示，P53和P21有利于結腸癌HCT116細胞拮抗葫蘆素所誘導的細胞凋亡［11］，提示葫蘆素B所引起的P21表達上調可能與腫瘤細胞的抗凋亡作用有關。雖然多數研究顯示葫蘆素 B 可誘導腫瘤細胞凋亡［5，8-9，12-13，35］，但仍有一部分研究表明該藥對細胞凋亡無明顯影響［3，6，14，19］，甚至具有抗凋亡作用［37-39］。可見，其誘導腫瘤細胞凋亡的機制待深入研究。

2.5 葫蘆素B對活性氧的影響

很多腫瘤細胞中活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量較高，有利于腫瘤的增殖和轉移，并且與腫瘤的耐藥性有關。有研究表明葫蘆素類藥物具有抗氧化作用［2，40］，但Yasuda等［12］發現葫蘆素B引起SW480細胞內ROS升高，并以ROS依賴的方式誘導細胞凋亡。這些研究表明，葫蘆素B對ROS的影響可能因細胞而異，還需深入研究。

3 展望

葫蘆素B作為葫蘆素家族的重要成員，其抗腫瘤作用日益受到重視。雖然其抗腫瘤活性可能與抑制STAT3活化有關，但越來越多的研究表明，葫蘆素B的抗腫瘤作用與其破壞肌動蛋白細胞骨架的活性關系密切。因此，深入研究其干擾肌動蛋白細胞骨架的作用，將為葫蘆素B以肌動蛋白骨架為靶點的抗腫瘤治療奠定實驗基礎。

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