神經發育毒性動物實驗替代方法研究進展

張楠楠，梁錦鋒，宋淑亮，吉愛國

(1.山東大學藥學院生化與生物技術藥物研究所，山東 濟南 250012;2.山東大學威海國際生物技術研發中心，山東 威海 264209;3.浙江省藥品不良反應監測中心，浙江 杭州 310012)

發育中的神經系統對于很多工業化學物和污染物具有較強的易感性，由于血腦屏障尚未發育完全，某些毒劑在發育腦中的積累量會高于成人，而且發育過程中化學物暴露能引起持久的神經功能障礙［1］。而神經功能損傷會給家庭和社會帶來沉重的負擔，因此，對化學物的神經發育毒性(developmental neurotoxicity，DNT)的潛在危害進行評價尤為重要。現行DNT實驗的標準是由美國環境保護署頒布的OPPTS 870.6300及世界經濟合作與發展組織頒布的TG426草案，但是這些實驗均采用整體哺乳動物進行研究，費用高、時間長且動物需求量大，很難利用其對500多萬種化合物進行DNT檢測［2］。另外，以替代、減少和優化為核心的動物實驗替代方法已被越來越多的科學家所認同，因此，建立動物替代實驗來快速和可靠地鑒定化合物的DNT已經迫在眉睫。本文對DNT實驗替代方法的建立原則及其研究進展進行了綜述。

1 神經發育毒性實驗替代方法的建立原則

理想DNT實驗替代模型最重要的特征就是模型的科學有效性，這就意味著它能預測人類處在發育階段的神經系統的神經毒性反應［3］。在遺傳毒理學中，模型的預測能力是由檢測終點與已知毒理學生物機制之間的關聯性所決定的，同樣，理想的DNT實驗替代模型就是以與DNT相關的保守生物機制為基礎的。理想的DNT實驗替代模型的另一個特征是靈敏、專一并且適合高通量篩選［4］。在這些特征的基礎之上，結合替代、減少和優化原則以及神經發育生物學的現狀，目前有兩類模型系統作為DNT實驗的替代模型:體外細胞模型和非哺乳動物模型。下面主要討論這兩類模型系統在DNT實驗中的應用以及它們實現替代、減少和優化原則的潛能。

2 神經發育毒性實驗的替代方法

2.1 體外細胞模型

神經毒性效應可以在總體形態或基礎行為不變的情況下產生，若要發現未受損大腦中細微的結構改變(如細胞數目或位置的改變以及突觸連接的變化)，不僅耗時長，有時還需要依靠專業的技能和昂貴的儀器設備。另外，由于人們尚不了解可能受到毒性物質影響的腦區以及在神經系統發育過程中會出現毒性反應的具體階段［5］，因此，利用上述技術進行大量化學物篩選不僅花費驚人，而且并不能保證可以檢測到突觸連接、神經遞質功能或細胞信號轉導的改變。

體外細胞模型能夠成為DNT實驗替代方法，主要原因有:①利用體外細胞模型模擬神經發育過程中的關鍵事件，可以檢測到細胞增殖、細胞結構以及神經遞質合成或功能上的輕微變化。②從體外細胞模型的數據可研究相關的分子、細胞、局部區域以及易受損傷的發育階段，因此，集中并且減少了動物研究。③許多DNT物質，不論其具體作用機制如何，都具有相同的毒性作用終點，如改變細胞分裂或存活、擾亂神經元或膠質細胞的分化以及中斷神經連接。因此，在細胞模型中所檢測到的毒性作用終點均在生物學上與DNT相關。④體外細胞模型有利于描述遺傳毒性的作用機制以及評價物種間作用機制的保守性［6］。通過檢測神經細胞基因表達，可以將分子數據及結構與功能上的觀察結果整合到一起，這類整合的數據庫對于利用分子終點進行的篩選實驗是必要的。

目前，細胞模型可用于研究神經發育過程中的關鍵事件，包括增殖和凋亡［7］、胚胎干細胞分化［8］、神經細胞遷移［9］、軸突樹突生長和突觸發生［10］、神經膠質細胞分化和髓鞘形成［11］、神經遞質合成與功能［12］以及血腦屏障生成［13］。常用模型有神經元型細胞系和膠質型細胞系［14］，還有從神經系統不同發育階段分離的組織，包括純化的原代神經元細胞和膠質細胞，神經元-膠質細胞共培養，器官型腦片培養［15］。其檢測終點有細胞形態、生化標記、神經傳遞和分子事件，如基因表達和細胞內信號轉導［16］。Radio等［17］以軸突生長為檢測指標，建立了PC12細胞的DNT高通量篩選系統，能快速量化化學物對軸突生長的化學效應，并且細胞活力和軸突生長的濃度響應數據可以作為化學物DNT的檢測終點。腦片等一些復雜的體外模型，已用于與功能相關的復雜行為研究，比如長時程增強和突觸可塑性［18］。

在體外神經生物學研究中，分離的大鼠小腦顆粒細胞是應用最廣泛的體外系統，90%原代培養的小腦顆粒細胞是由小腦顆粒神經元組成，可以用于神經元的發育、功能和病理學研究。盡管沒有神經電路，小腦顆粒細胞卻具有多條功能通路對化學物進行應答［19］。總之，相對于細胞系，原代培養物對毒性物質有更高的敏感性［20］。原代培養的小腦顆粒細胞中還包含膠質細胞，其中，星形膠質細胞可特異性地表達膠質纖維酸性蛋白，它是星形膠質細胞骨架蛋白的特有成分，常作為星形膠質細胞毒性反應的特異性標志物，用于研究膠質細胞的毒性反應［16］。

迄今為止，大多數機制信息是通過對非干細胞正常增殖、永生或致瘤細胞的研究而獲得的。多數情況下，這些結果外推到體內后不是很理想。干細胞技術為更好地理解毒性機制和預測人體內毒性提供了一種新的工具［21］。理想的DNT模型是人胚胎干細胞。人神經祖細胞、干細胞系和臍帶血干細胞等模型，可用于研究前體細胞向神經元和膠質細胞的分化以及神經網絡形成等神經發育過程中的重要事件，而且這些模型可以避免物種不同所致的推測不確定性［22］。Breier等［23］用多種化合物作用于人神經祖細胞，通過PI排除法和BrdU摻入法檢測細胞活力和增殖情況，建立了以人神經祖細胞為對象，采用高通量篩選方法評價化學物對細胞增殖和活力的影響的DNT檢測體系。

雖然體外細胞模型能夠對化學物進行神經系統毒性作用篩選，優化和減少動物實驗，但是，也存在局限性:① 大部分細胞系是從腫瘤中得到的永生細胞，不能代表天然神經細胞真實狀態，原代細胞的很多性質會丟失或與體內情況不同。隨著傳代，基因組的不穩定性增加。缺少三維結構，不同細胞類型之間的相互作用變得非常有限。②原代培養物中，細胞表型和功能會發生改變，細胞代謝和細胞間相互作用水平顯著降低，這會導致細胞對化學物的回應發生改變。另外，初級神經培養物大部分由有絲分裂后的神經元組成，這些細胞不能增殖，模型的生存期受到限制，因此，培養物需要經常更換，不適合進行高通量篩選。③ 尚不能完全控制神經祖細胞的分化，對其很多培養特征缺乏了解［24］。④ 發育中的大腦，其基因表達類型、發育周期、神經保護分子的表達和代償性機制會因部位的不同而不同，因此，體外細胞模型很難解釋神經毒性物質對大腦不同部位的毒性作用［18］。⑤神經毒性物質對整個神經系統的作用大于對各個部分作用的總和。這樣，將發育中的神經系統簡化到細胞亞群或某一區域的腦片，就不能從總體上研究大腦不同區域、不同細胞類型和不同發育階段間的相互作用和重要差別，而且不易觀察到毒性物質對可以影響神經發育的神經外因子(如代謝、免疫調節和內分泌功能)的毒性作用［25］。

2.2 非哺乳動物模型

發育中的神經系統具有很多比較復雜的相互依賴過程，所以，體外細胞模型很難準確地預測化學物的體內效應，而那些簡單生物體構成的非哺乳動物模型可以評價完整的生物效應，為DNT實驗提供更可行和更快速的替代方法。線蟲、果蠅和斑馬魚已廣泛用于神經發育機制的研究，而且已經掌握它們關于神經發育的細胞和分子調節方面的相關理論。研究證實，盡管這些模型的神經發育與哺乳動物有明顯的差異，但是它們神經發育的基礎進程與人具有相似性，而且所表達的基因與人神經發育疾病相關的基因存在較高的同源性，這說明這些模型系統可以用于檢測化學物對人發育中的神經系統的潛在神經毒性［26］。

隨著線蟲、果蠅和斑馬魚基因組測序的完成，已經有能夠監測和調控這些生物體中基因表達的技術，而且某些行為測試也已被開發出來，利用這些工具可以在生物化學、分子和細胞水平上對DNT引起的結構、功能和行為的改變進行研究，還可以直接檢測化學物與生物化學、細胞或分子終點以及行為的原因-效應關系［27］。另外，這些信息可以構建用于預測物種間DNT潛在危害的基因組學和蛋白質組學數據庫。以后的研究主要集中在發展適用于非哺乳動物模型的基因組學、蛋白質組學、結構、生物化學和行為學終點的高通量分析技術。

非哺乳動物模型的一個最重要的優勢就是這些組織體積小，胚胎發育快，生活周期短，這大大減少了時間和空間上的消耗。在這些模型中，斑馬魚呈現出很多線蟲或果蠅所沒有的特征，如在基因組結構上脊椎動物和無脊椎動物之間有很顯著的差異。這樣，即使物種間基因具有功能同源性，但是基因調節的機制在脊椎動物和無脊椎動物之間會有明顯的不同［28］。而且，無脊椎動物神經系統不能反映脊椎動物大腦的大小和組成，脊椎動物神經電路的復雜性排除了它們與無脊椎動物之間對大腦的形成和功能進行直接比較的可能性，但是，魚類大腦的主要組成部分卻與人腦具有高度的同源性［29］。斑馬魚還具有所有的經典感覺形態，包括視覺、嗅覺、味覺、觸覺、平衡和聽覺，并且它們的感覺傳導通路與人完全相同。認知行為測試表明解剖學上擔負認知行為的物質在魚和其他脊椎動物之間是保守的，這樣，與對哺乳動物海馬損傷的觀察相類似，魚中的海馬結構類似物損傷選擇性地損害了其空間記憶［30］。

與其他模型相比，斑馬魚的另一個優勢是其胚胎透明，簡單的顯微技術就能在較寬的發育階段內分辨體內單個細胞，而且，采用能表達熒光報道基因的轉基因斑馬魚模型可使分辨率提高，用以觀察基因表達的動態變化和活體中發育胚胎詳細的形態發生運動，進而可以研究在神經系統發育過程中暴露于神經毒性物質時的補償機制［31］。在活體斑馬魚中可見的神經發育事件，包括神經誘導、神經元遷移、軸突向外生長和突觸發生、后腦形態發生的分子調控以及視覺系統的發育［32］。而且利用這些過程在同一個生物體中的重現性還可以進行反復的觀察，因此減少了研究中的動物使用量。Yang等［33］將受精24～72 h的斑馬魚受精卵暴露于毒死蜱的代謝產物后，發現其代謝產物能顯著抑制乙酰膽堿酯酶的活性，并且抑制感覺神經元、初級運動神經元和次級運動神經元的軸突生長，由此表明神經連接方式的改變是毒死蜱DNT的一種表現形式。Powers等［34］將斑馬魚胚胎長期暴露于對形態發育不產生明顯影響的銀離子濃度中，通過對斑馬魚神經化學指標和行為效應的檢測，證明銀離子是一種能夠引起永久神經行為效應的神經發育毒劑。

作為模型物種，斑馬魚為研究提供了很多方便，但是它也有一定的缺陷。它的小體積使得生化或遺傳分析對胚胎或幼蟲的需求量增大，同時也極大地限制了檢測和評估裝置的類型，給包埋和切片增加了難度。其次，斑馬魚發育進程迅速，僅幾個小時就可以使其發育階段或對毒性物質的敏感性發生改變，這使得記錄發育時段的觀察費用得以增加。另外，斑馬魚胚胎起初被包在絨毛膜內，它可能會成為某些化學物進入胚胎的額外屏障。雖然胚胎的卵膜可以通過機械法或蛋白酶法去除，但這會影響胚胎的行為和完整性，同時也排除了檢測化學物對孵化影響的可能［35］。在毒性研究中，斑馬魚最主要的缺陷是給藥的不可控性。最簡單的暴露方式是將胚胎置于含有毒性物質的溶液中，但實際到達胚胎的劑量是不確定的。已有研究表明，真正到達胚胎/幼蟲的劑量極少會與周圍水中的藥物濃度相接近［36］。

總之，以非哺乳動物為基礎的體內DNT實驗替代模型所面臨的主要挑戰是要確定潛在的物種間毒性物質代謝動力學和毒性物質效應動力學的差異。目前已有關于外源物與人在代謝和細胞防御機制上相似程度的探討，如果二者之間存在顯著差別，那么，利用通過穩定表達人類基因(如代謝酶類)而使其人源化的技術，可能使這個難題得到部分解決［37］。

3 神經發育毒性實驗替代方法存在的問題和展望

基于神經發育保守機制的DNT替代模型的重要特征是可對發育中的人神經系統的神經毒性反應進行預測，因此，無論基于細胞培養的體外模型還是基于非哺乳動物的體內模型，都有必要對其是否具有這一特征進行評價。理想DNT替代模型的另一個特點是應用于高通量分析，而且要具有敏感性、專屬性和適用性等優點。另外，還要求快速、經濟并且相對容易實施。但是，總體上，無論是體外還是體內替代模型，均存在如下問題:①其所得數據均不能對預測的準確性、專屬性和敏感性進行充分的評價。所以，目前要做的工作是建立一組可以檢測DNT實驗替代模型的參照化合物［38］，進而利用這些不同機制的DNT化合物對不同候選模型進行測試。②DNT實驗數據的收集、存儲和分析。最理想的情況是每一個參與者在公共數據庫中共享DNT實驗替代模型發展和檢測的相關信息。除了要鑒別收集有關資源來建立和維持這個數據庫，還要運用計算毒理學與系統生物學，使結構和功能的數據與基因組學、蛋白質組學和代謝組學得以結合［37］。

從體外細胞模型和非哺乳動物模型的DNT實驗替代法獲得的數據，有利于對相關細胞、分子和局部靶點更深入的理解，由此可以提出化學物作用方式的相關假說，鑒別潛在的易損發育階段，繼而優化和減少哺乳動物體內實驗，實現保障兒童健康的最終目標。目前，雖然DNT替代實驗不能完全取代哺乳動物體內實驗，但是，DNT替代模型在區分化學物以及優化和減少哺乳動物體內實驗中有重大價值。

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