淺析動物源細菌抗生素耐藥性的現狀與對策

周 煒，陳慧華，周芷錦，魯馬媚，穆 琳，應永飛

(浙江省獸藥監察所，杭州 310020)

2010年，一種可抗絕大多數抗生素的超級細菌在英國、美國印度等國家爆發，一度引起全球性恐慌。一時間，亞洲國家對抗生素的不正當使用，成為眾矢之敵。盡管尚無明確證據表明人源細菌耐藥性來源于動物源細菌，但公眾已然將矛頭直指獸用抗生素的濫用。當前形式下，如何正確地認識并了解動物源細菌耐藥問題已然成為關系到人類自身安全和畜牧業健康發展的重要問題。

1940年，青霉素剛開始投入臨床時的藥敏實驗顯示，所有金黃色葡萄球菌(簡稱“金葡菌”)均對其敏感。自1942年，Ramel-kamp和Maxon首次報道出現對青霉素耐藥的金黃色葡萄球菌后[1]，科學界就對細菌耐藥性形成機制、耐藥性監測等諸多問題進行了深入研究。基于對人類自身安全及我國畜牧業的健康發展因素的考慮，我國于20世紀90年代就開始了對動物源細菌耐藥性的研究，主要針對重點養殖區的動物源大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌的耐藥性。2000年中國獸醫藥品監察所開展了對華東地區雞源和豬源性大腸及沙門氏菌的耐藥性背景調查。2008年我國開始建立了由中國獸醫藥品監察所、遼寧、上海、四川、廣東省(市)獸藥監察所和中國動物衛生與流行病學中心組成的動物源細菌耐藥性監測系統，3年間主要開展了對大腸桿菌、沙門氏菌對14種抗菌藥物敏感性的研究，并已取得初步進展。本文簡要介紹了細菌耐藥性的形成與傳播途徑，就動物源細菌耐藥性的現狀及危害問題，提出了幾點針對性建議，并簡要總結了我國動物源細菌耐藥性研究的進展。

1 細菌耐藥性形成與傳播

細菌耐藥性又稱細菌抗藥性，系指細菌對于化療藥物作用的耐受性，耐藥性一旦產生，藥物的化療作用就明顯下降。

耐藥性根據其發生原因可分為天然耐藥和獲得性耐藥。天然耐藥又稱固有耐藥，不是通過細菌基因的改變，而是由于細菌自身獨特的細胞表面結構、對化學藥物具有特殊的代謝或流出途徑、對化學藥物降解酶具有特殊的生物合成途徑等因素而形成的對抗生素的天然耐藥[2-4]。例如大腸桿菌和沙門氏菌由于其細胞膜具脂多糖厚的特點，而對大環內酯類藥物具有天然耐藥。獲得性耐藥，則是細菌通過基因突變或水平基因轉移而獲得。當長期應用抗生素時，占多數的敏感菌株不斷被殺滅，耐藥菌株則大量繁殖，代替敏感菌株，而使細菌對該種藥物的耐藥率不斷升高。

耐藥性細菌可從人、動物和食品中分離得到，因而細菌耐藥又可分為動物源、食源和人源三種。2011年5月～7月在德國、西班牙、法國等歐盟國家爆發的腸出血性流行病就是食源致病菌—腸出血性大腸桿菌(EHEC)和腸黏附性大腸桿菌(EAEC)，經德國斯特大學的研究小組研究發現，這兩種致病菌對所有種類的青霉素及頭孢菌素均有耐藥性。值得注意的是，動物源細菌耐藥并非指耐藥菌株的耐藥基因來源于動物源細菌，而系指從動物體內、體表分離得到的菌株具有耐藥性。

1.1 細菌耐藥性的形成機制 抗菌藥物產生抗菌作用的兩個必要條件是:抗菌藥物的有效作用濃度、抗菌藥物與作用靶位的結合。因而微生物耐藥的作用機制可分為分為細菌酶對抗生素進行修飾使其失活、減少抗生素進入、增加抗生素流出[5-7]以及改變或置換抗菌藥物作用靶位等機制。

抗生素的失活與修飾是細菌通過獲得編碼水解或修飾抗生素的酶的基因而產生的耐藥性，迄今為止，已發現并證實細菌中存在190多種β-內酰胺酶，可以破壞青霉素或其它β-內酰胺酶類抗生素[8]。有研究表明，2010年引起全球性恐慌的超級細菌就是因其形成了編碼新德里金屬蛋白酶-1(New Delhi-Metallo-1，NDM-1)的基因，能對多種抗生素進行修飾。減少抗生素進入類耐藥主要是細菌通過改變細胞膜通道蛋白或改變膜(莢膜、外膜等膜結構)的理化性狀而獲得的耐藥性。因流出系統而獲得的耐藥則較為復雜，主要作用機制是通過質子力或ATP水解泵出膜通道兩種，此類耐藥與天然耐藥性及多重耐藥性有關。抗菌藥物作用靶位的改變或置換主要與細菌內基因改變有關，如GyrA基因突變導致氟喹諾酮類藥物與作用靶位結合率降低而形成的耐藥[9]。

1.2 細菌耐藥性的獲得與傳播 細菌主要通過基因突變及水平基因轉移兩種方式獲得耐藥性，獲得的耐藥性又可通過垂直和水平傳播兩種途徑進行傳播。基因突變(DNA/RNA的突變)是細菌在外因的誘導下自發進行的。盡管發生頻率較低，但在優勝劣汰的自然選擇下，突變優勢通過親代與子代菌株之間的垂直傳播得以幾何倍增。

水平傳播則又可分為轉化、接合和轉導三種[10]。轉化發生在一些鏈球菌、彎曲桿菌上，這些細菌可從環境中攝取由死菌體細胞釋放出來的游離的耐藥DNA片斷，這些DNA片斷在內化后，可整合到受體染色體上，也可作為染色體DNA自我復制。接合是耐藥基因片段以自動轉移質粒或可移動質粒為載體由供體菌向受體菌轉移的過程，而轉導則是以噬菌體介導轉移。水平傳播可能發生在不同菌屬之間。這些質粒、整合子或轉座子常攜帶多個耐藥性標記，大質粒常傳遞多種耐藥性機制，形成多重耐藥[7]。

2 動物源細菌耐藥性的危害

大量研究表明，1700多種感染性微生物中近50%是動物源性的[11]。同時，與人源性耐藥菌相比，動物源病原菌耐藥譜廣、耐藥強度強，因而動物源細菌耐藥性危害性更強。

國際上對動物源細菌耐藥危害性的調查研究可上溯到20世紀60年代。1969年英國聯合委員會(UK Joint Committee)發布了Swann報告，警告食品動物使作亞治療劑量抗菌藥物用作促生長劑造成的耐藥菌可能危及人類健康。自此，諸多發達國家開始著手對動物源細菌耐藥性進行監測及流行病學調研[12]。1997年日本發生了引起人們極大恐慌的O157大腸桿菌風波及沙門氏桿菌食物中毒事件，后經證實與動物源致病菌的耐藥性有關，動物源細菌耐藥性對人類健康的直接危害首次得以確認[13]。

3 動物源細菌耐藥性的檢測方法

目前，動物源細菌耐藥性的研究方法主要依據臨床和實驗室標準化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)制訂的《動物源細菌的抗微生物藥物紙片擴散法和稀釋法敏感度試驗執行標準;認可標準——第三版》進行體外細菌培養藥敏性試驗。紙片擴散法是將含有抗生素的紙片貼于接種了被檢菌的瓊脂平板表面，在培養一定時間后測量抑菌圈直徑，因不同直徑處藥物濃度無法準確測定，故主要作為定性試驗。肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法的檢測原理相似，都是向培養基中加入已知濃度的特定抗生素，用以確定最低抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration，MIC)，因而可作為半定量分析。E-Test作為一種改良型紙片擴散法，是將一定濃度梯度的抗生素附著于薄膜試紙上，因而能根據開始出現抑菌圈的試條位置確定MIC。根據CLSI的解釋，上述四種藥敏檢測方法僅限于標簽范圍內使用的治療性抗菌藥物，對于預防及促生長用的抗菌藥物、抗菌藥物標簽外使用(諸如:改變用藥范圍、使用劑量、給藥途徑等使用情況)，因其使用效果與體外藥敏試驗結果的關聯度無法評估，而不適用。

近年來，隨著基因技術的發展，聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)、基因芯片等針對特定耐藥基因片段的研究正逐步興起，突破了常規方法對被檢菌生長速度的限制這一技術瓶頸，為耐藥菌分型、耐藥性基因的溯源研究提供了技術平臺，但亦存在只能檢測已知耐藥基因、基因與表型不一致造成假陽性等局限性。

由于以上檢測均為被檢菌的體外藥敏試驗，因而依然存在假性耐藥和假性敏感的可能，假性耐藥即[2]:有些抗菌藥在體外藥敏試驗呈耐藥，但在被檢菌宿主體內仍具抗菌活性的現象;假性敏感即:某一特定抗菌藥物在體外試驗中對某些確定的細菌有抑菌或殺菌活性，但在臨床治療上是無效的，例如第一代和第二代頭孢菌素和氨基糖苷類對沙門氏菌Salmonella spp.均呈現假性敏感[14]。

4 動物源細菌耐藥性的現狀及發展趨勢

隨著規模化、集約化養殖的迅猛發展，畜禽養殖業對抗生素的過度依賴，致使了細菌耐藥性問題日趨嚴重。與此同時，由于存在“耐藥性出現→過量使用或濫用抗菌藥物→耐藥譜或耐藥水平加重”這一惡性循環[12]，致使動物源細菌耐藥性問題不斷惡化。就全球范圍而言，動物源細菌耐藥性總體表現出如下幾大特點:

4.1 細菌耐藥性產生迅速 目前，國際上新獸藥的研發期平均為10年，而細菌產生耐藥性僅需2年。1940年，青霉素剛開始投入臨床時的藥敏實驗顯示，所有金黃色葡萄球菌均對其敏感。1942年，Ramel-kamp和Maxon報道出現對青霉素耐藥的金葡菌，其實際出現時間應為1941年。1984年氧氟沙星上市不久，美國、法國、德國、日本等國家就報道有耐藥菌株出現。安普霉素在獸醫臨床上使用不到兩年就出現耐藥大腸桿菌、沙門桿菌[13]。

4.2 多重耐藥性上升 宋立等[15]對326株20世紀70年代至本世紀初分離保存的大腸桿菌對氨芐西林、慶大霉素等20種抗生素的耐藥性進行了試驗，結果表明:70年代大腸桿菌耐藥1～7種，80年代的則耐1～9種，而90年代90%以上的大腸桿菌耐4～11種，到2000年96%的大腸桿菌則能耐8～16種。潘志明等[16]對1962～1998年間分離保存的325株雞白痢沙門氏桿菌進行耐藥性測定，發現其耐藥譜不斷增寬，70年代四耐、五耐菌株居多，80年代五耐、六耐、七耐菌株占絕大多數，90年代七耐以上菌株比例近90%。

4.3 耐藥強度不斷增強 細菌耐藥性另一重要指標就是耐藥菌株的MIC。隨著耐藥性的產生，養殖戶盲目加大用藥量，促使致病株耐藥強度不斷增加。敏感型大腸桿菌對喹諾酮類藥物(氧氟沙星)的 MIC≤2 μg/mL[14]，雷連成等分離得到 MIC 為256 μg/mL 雞致病性大腸桿菌[17]。

4.4 耐藥性傳播速度加快 20世紀60年代首次發現耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，80年代這一菌系便遍布全球。如今，隨著全球交通、物流的大發展，使得耐藥菌株耐藥性的傳播速度不斷提高。2007年耐碳青霉烯肺炎雷伯氏菌在美國弗吉尼亞州爆發，至2010年，該耐藥菌便在巴西、以色列等國相繼爆發。

5 動物源細菌耐藥問題的對策

5.1 正確認識細菌耐藥性 就整體而言，我國畜牧業從業人員素質不高，對如何科學、合理使用抗菌藥物缺乏相應的專業技術知識。由于獸醫臨床和飼料添加劑中抗生素用量、種類、范圍不斷增加和擴大導致動物源性細菌耐藥問題日趨惡化，加之一些獸醫和飼料添加劑生產商非法使用或添加僅限于人用的抗生素，進一步加重了動物源細菌耐藥性對人類健康的威脅。因而，首先必須加強廣大畜牧業從業人員及相關管理人員對動物源細菌耐藥問題的嚴重性和緊迫性的認識，從源頭上減少耐藥性產生的條件。

在經歷了耐藥菌惡性爆發的事件后，細菌的耐藥性已有讓人談虎色變之嫌。但是，事物均有兩面性，我們在看到細菌耐藥問題嚴重性的同時，還應當從另外兩個方面正確認識細菌耐藥性。①微生物產生耐藥性并非都是壞事，如人體內正常菌叢，其產生的耐藥性在保護自身的同時，也能確保不易發生菌群失調，不給真菌等條件致病菌以可乘之機。②并非所有抗生素均會迅速產生耐藥性。臨床上，根據抗微生物藥物發生耐藥性的可能性，抗生素可分為高耐藥可能性藥物和低(或無)耐藥可能性藥物[2]，前者臨床應限制使用，如氨芐西林、慶大霉素、四環素、環丙沙星;后者臨床可不限制或優先使用，如阿米卡星、多西環素、頭孢吡肟等。因而，并非所有抗生素不能用，有針對性的正確使用還是可行的。

5.2 加強對獸用抗菌物的管理 我國獸醫領域尚未建立處方藥與非處方藥制度，是抗菌藥不合理使用、濫用和非法使用重要原因，建議今后應將抗菌藥物列入處方藥的規范管理，只有獸醫師有才權使用抗菌藥，保障原則上盡量選用窄譜抗菌藥物，并盡可能地盡早根據藥敏試驗選藥。與此同時，還可采取限用策略，如輪作制，即將一類抗菌藥停用一段時期后再用，以恢復細菌對該類藥物的敏感性。在人獸共用抗菌藥方面，我國各級管理機構應當嚴格控制人用抗菌藥在畜牧業上的使用，尤其是新型抗生素，以切斷耐藥性的傳遞途徑。

5.3 開展深入持久的動物源細菌耐藥性監測 就國家層面而言，開展動物源細菌耐藥性的監測工作勢在必行。通過統一的具可比性的方法在全國或重點代表性區域開展耐藥性調查研究，掌握我國目前抗菌藥耐藥性的流行情況，為各級畜牧業行政主管部門制定抗菌藥物管理政策提供數據支撐;通過建立健全動物源細菌耐藥性風險評估體系，為預防及控制耐藥性致病菌的大規模爆發提供科學依據。

6 我國動物源細菌耐藥性研究進展

綜上所述，國內外科學界已對動物源細菌耐藥性的產生及危害、檢測方法等諸多方面進行了多年深入研究。盡管，國內學者對動物源細菌耐藥性的研究不斷取得突破性進展，但與國外同行相比，仍處于起步階段。如需果要建立細菌耐藥性風險評估體系，為實際預防及控制耐藥性致病菌的爆發提供數據支撐，還需要更為長期、覆蓋面更廣的細菌耐藥性監測。此外，在耐藥菌株亞型定型及溯源等更為深入的探索，亦有待國內研究者的不懈努力。

[1]吳安華.抗菌藥物的發展與細菌耐藥[N].中國醫藥報，2004.

[2]孫忠實.抗微生物藥物耐藥性的產生與對策[J].浙江省中醫院藥訊，2010，3:26.

[3]肖 瑤.細菌耐藥機制研究進展[J].北京醫學，2011，3(33):228-231.

[4]Hoothon T M，Levy S B.Antimicrobial resistance:A plan of action for community practice[J].Am Fam Physician，2011，63:1087-1098.

[5]呂曉菊.細菌耐藥的機制與對策[J].臨床內科雜志，2007，24:295-297.

[6]單 霞，黃 茂.細菌多重耐藥與整合子—基因盒系統[J].醫學綜述，2010，16:354-356.

[7]Piddock L J.Multidrug-resistance efflux pumps-not just for resistance[J].Nat Rev Microbiol，2006，4:629-636.

[8]張啟 敬.Antimicrobial resistance:mechanisms，detection and control.中美動物源細菌耐藥性檢測與獸藥風險評估研討會資料[C].2010.

[9]范 柏.喹諾酮類抗菌藥的作用機制及細菌耐藥性的研究進展[J].國外醫藥抗生素分冊，2004，1:27-29.

[10]Anderl J N，Zahller J，Roe F，et al.Role of nutriaent limnitation and stationary-phase existence in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin[J].Agents Chemother，2003，47:1251.

[11]金少鴻，馬 越.國內細菌耐藥性監測研究的回顧與展望[J].中國抗生素雜志，2005，5:257-283.

[12]吳聰明，汪 洋.動物源細菌耐藥性監測與流行病學研究[J].中國獸藥雜志，2010，44(1):23-25.

[13]張心如，羅宜熟，杜干英，等.動物源性耐藥菌與人類安全[J].獸藥與飼料添加劑，2004，3(9):3-6.

[14]CLSI.動物源細菌的抗微生物藥物紙片擴散和稀釋法敏感度試驗執行標準[S];第三版，2008.

[15]宋 立，寧宜寶，沈建忠，等.中國不同年代食品動物大腸桿菌耐藥性調查研究[J]，中國科學 C輯:生命科學，2009，7:692-698.

[16]潘志明，焦新安，劉文博，等.雞白痢沙門氏菌耐藥性的監測研究[J].畜牧獸醫學報，2002，33:377-383.

[17]雷連成，韓文瑜，鄭 丹.大腸桿菌流行株耐藥特性對其免疫效果的影響[J].吉林農業大學學報，2005，5:554-558.