豬瘟防控技術研究進展

王 琴，范學政，趙啟祖，徐 璐

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

豬瘟又稱經典豬瘟(Classical swine fever，CSF)，是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起豬的高度致死性、接觸性傳染病，是嚴重危害全球養豬業的重要傳染病。近10年來，中國獸醫藥品監察所在豬瘟的流行病學、信息系統的建立、診斷系列新技術研發、疫苗效檢替代方法、致病機制及標記疫苗的研究以及豬瘟的防控與凈化方面所取得了突破性進展，現綜述如下。

1 我國豬瘟病毒分子流行病學及信息系統的研究

CSF分子流行病學調查研究對闡明CSFV的遺傳變異特征和規律，掌握當前的流行現狀，溯源和追蹤CSF疫情發生的來源和去向，監測現行使用疫苗的有效性，建立分子流行病學監測系統，提出新的防制策略具有十分重要的科學意義。

國際上將CSFV分為3個基因群(Ⅰ群、Ⅱ群和Ⅲ群)，10 個基因亞群(1.1、1.2、1.3、2.1、2.2、2.3、3.1、3.2、3.3 和 3.4)［1］。為弄清我國 CSF 流行病學本底，中國獸醫藥品監察所和軍事獸醫研究所分析了我國31個省市自治區自1979到2010年間的554條E2基因序列，表明我國流行毒株均為4個基因亞群(2.1、2.2、2.3 和1.1)，以基因 2 群(73.82%)為主，其次是 1 群(26.18%)。一直沒有監測到基因3群的傳入與流行，但在周邊國家和地區如韓國、泰國、臺灣等均有基因3群，應嚴密加強監測［2］。多年一些學者認為流行毒株免疫基因正在朝著遠離疫苗的方向變異，導致免疫失敗，對上述從1979-2010年流行毒株與疫苗株E2基因核苷酸同源性進行逐年分析，發現疫苗毒株抗原基因與流行株同源性在2007年最低，為76.2%，疫苗免疫保護試驗也證實了我國目前使用的疫苗對同源性在76.2%以上的流行毒株攻擊依然有效［3］。中監所曾用不同時間、不同地點、不同基因亞群和不同致病力的野毒株進行單獨、混合、一次、多次或交叉攻毒，結果接種豬均能得到完全保護［4］。為此在我國使用HCLV進行高密度(100%)強制免疫，仍然是有效的政策，筆者建議在今后的監測工作中，如發現流行毒株與疫苗株E2基因同源性低于76.2%時，應及時進行免疫保護實驗并監測疫苗的有效性。國際上對CSFV的分子流行病學研究，以位于德國漢諾威(Hannover)的歐盟CSF參考實驗室研究數據最為完善，該實驗室收集了來自35個國家E2基因數據已經接近1000條。我國經過多年的CSFV分子流行病學調查研究，弄清了中國CSFV的遺傳衍化背景，填補了國際上CSFV分子流行病學研究缺乏中國數據這一空白，表明我國CSFV遺傳變異情況在32年間處于穩定狀態。通過調用歐盟CSF參考實驗室的部分基因數據，有助于分析我國豬瘟流行病學數據，為防治提供依據。我國養豬模式多樣，生態環境多樣，繼續開展不間斷的分子流行病學跟蹤調查，實時跟蹤病毒變異特征及抗原性變異程度，監測新的流行毒株的情況和疫苗對流行毒株的有效性，不僅對我國CSF防制具有重要的指導意義，對建立該病毒的全球監測體系具有深遠意義。

中國獸醫藥品監察所聯合軍事獸醫研究所、中國動物衛生與流行病學中心將CSF流行病學信息數據與數據庫技術、GIS技術、生物信息學技術相結合。采用ArcGIS桌面產品、ArcMapObjects軟件和Delphi軟件，在中國數字地圖的數據支持下，創新性的建立了CSF流行病學信息系統(CSFinfo)，使我們成為全球繼德國之后第二個有這種數據庫的國家［5］。CSFinfo對加強CSF流行病學信息的統一管理，掌握全球CSF數據，分析CSF傳播來源，建立一整套連續、可靠、完整、系統的國內外CSF流行病學資料，對我國CSF防控具有十分重要的意義。

2 豬瘟病毒致病機制

CSFV的3’UTR被認為與病毒基因組的復制、翻譯以及復制和翻譯的調控有關，序列比對發現HCLV的3’UTR核苷酸的第61位有一個12-nt(CUUUUUUCUUUU)的插入序列，而在強毒SM株以及其它毒株中缺失。為研究這一特征性序列的生物學功能，構建兩個突變株感染性cDNA克隆，一株是在強毒SM株基因組pT7SM感染性cDNA克隆 3’UTR的第 61位處插入了 12個堿基“CTTTTTTCTTTT”;另一個是 pT7SM 的3’UTR完全被HCLV基因組3’UTR所替換。結果兩個突變株在PK-15細胞上的增殖滴度比其親本株下降了約100倍，對實驗用豬產生了明顯減毒的現象，有效誘導宿主產生中和抗體并使宿主完全抵抗致死劑量SM強毒的攻擊，與HCLV十分類似。表明HCLV 3’UTR的12個堿基插入對CSFV復制和毒力有著重要影響，與疫苗減毒有重要關系。該結果也提示CSFV的非編碼區突變可以影響病毒的毒力，這對理解CSFV的減毒機理以及開發新一代疫苗提供理論依據［6］。

3 豬瘟診斷新技術

CSF的診斷多年來一直困擾著對該病的凈化策略，近年我國CSF診斷技術取得突破性進展。病原分子診斷技術已經達到國際水平，同時建立了抗體阻斷ELISA方法和抗體間接ELISA方法。

3.1 病原學診斷技術 中國獸醫藥品監察所和軍事獸醫研究所CSFV通用熒光RT-PCR試劑盒的建立，可對所有CSFV進行檢測，該方法十分成熟和穩定，獲國家專利(200610109404.X)并形成國標(GB/T27540-2011)，特別對非典型、溫和型及持續感染CSF的診斷提供一個快速、敏感、準確的方法，是適用于種豬凈化的可靠手段。我國CSF免疫采取的是100%強制免疫措施，建立快速、敏感、特異地檢測CSFV野毒的方法十分必要，CSFV MGB鑒別熒光RT-PCR方法的研制，為臨床鑒別野毒和疫苗毒提供了可靠的工具，該方法獲國家專利(CN2010242080.0)。歐盟CSF參考試驗室根據已知毒株的基因序列，鎖定主要保護性抗原E2基因區域的2467～2738之間共272bp的片段作為序列測定和分析目標，能反應不同毒株抗原基因序列的變化特點，是用于毒株間系統發生分析的首選公認區域［1］。本課題組對其改進優化，并進行了12年的臨床應用，該方法不僅可用于核酸的檢測和診斷，采用其擴增產物直接測序用于CSFV分子流行病學研究，達到了一舉兩得的目的［7］。

CSFV抗體標記技術有免疫熒光技術和過氧化物酶標記技術，也是OIE推薦的CSF病原檢測技術之一。采用從英國AHVLA實驗室引進的CSFV E2單抗WH303作為一抗，標記辣根過氧化酶的兔抗鼠二抗，建立了免疫過氧化物酶細胞單層試驗染色方法，用于CSFV TCID50檢測、疫苗定量、病毒分離鑒定、拯救重組CSFV的鑒定［8-9］，具有很好的特異性和準確性。直接對單抗WH303進行熒光素標記，制成熒光特異性抗體，直接與細胞或組織中相應蛋白抗原結合，在熒光顯微鏡下即可見抗原存在部位呈現特異性熒光。我所和軍事獸醫研究所采用該單抗(WH303)分別建立了CSFV免疫熒光試驗和CSFV間接免疫熒光試驗，較多抗標記法更特異和準確，容易分辨，錯判誤判率會大大減少，田間推廣應用容易，是CSF凈化的一項準確、特異和簡便的技術。

3.2 抗體檢測技術 CSF抗體水平檢測是疫苗免疫效果評價的主要方法，ELISA方法以其操作簡便、敏感、檢測樣本量大等優點成為其主要手段，研發國產化的準確度高的CSF抗體ELISA檢測試劑盒勢在必行。本實驗室采用桿狀病毒表達系統獲得CSFVE2基因可溶性表達產物(CN200810223406.0)，突破了診斷用抗原的關鍵制備技術;對單抗WH303進行純化和FITC標記，分別建立了 CSF間接ELISA方法和阻斷ELISA方法［10］。

抗體間接ELISA方法:采用中和實驗作為金標準與間接ELISA對232個陽性樣本和242個陰性樣本進行符合實驗，其敏感性符合率為90.95% ，特異性符合率為94.21%，兩種方法的總符合率為92.62%。該方法具有操作簡便，靈敏度高等特點，通過對血清中E2蛋白多抗的檢測，可全面反應豬體內抗體水平，適用于田間大規模免疫抗體水平普查、商品豬場免疫效果評價和不同免疫水平豬群的分群。

抗體阻斷ELISA檢測方法，對PRRSV、PRV、PCV、PPV、BVDV等病毒性疾病抗體(CSF抗體為陰性)無交叉反應。對285份臨床血清樣本的檢測結果表明，與IDEXX試劑盒的特異性為94.2%，敏感性為98%，兩種方法的符合性為97.5%。由于采用單抗WH303作為酶標抗體，大大了降低非特異性反應。該方法除用于田間大規模普查外，尤其適用于規模化種豬場和重點疫區抗體監測。制備成本較低，穩定性好，為我國CSF抗體水平的監測提供了重要的技術支持。

3.3 豬瘟兔化弱毒疫苗效檢替代方法的建立 豬瘟兔化弱毒株是世界公認的最安全、免疫效果最好的疫苗毒株，也是我國唯一使用的豬瘟疫苗毒株。由于家兔個體差異和標準化程度不高、檢測周期長有關，無疑提高了疫苗儲藏成本，因此家兔熱反應對疫苗效力檢驗結果不準確，建立新的準確簡便的替代方法，提高疫苗檢測質量，對其質量監控至關重要。我們建立的HCLV熒光定量PCR方法和單抗WH303直接免疫熒光檢測方法與兔熱反應比較，三者之間存在良好相關性，對CT值在17.10～20.81，病毒含量在8.27 ×104～1.11 ×106copy/μL，TCID50值在 10-2.88/0.1 ～10-4.54/0.1 mL 之間的疫苗半成品原液，可以按半成品疫苗原液每毫升能引起100萬個兔體定型熱反應進行配苗［11］。為疫苗效檢提供了一種快速、敏感、特異的方法，代替傳統的兔熱反應方法，更準確、快速指導疫苗的生產，縮短生產周期，產生更明顯的經濟和社會效益。

應歐盟CSF參考實驗室邀請，中監所從2009到2011年連續3年參加歐盟CSF參考實驗室組織的來自42個國家50個實驗室的CSF診斷比對實驗。采用了本實驗室建立的CSFV通用熒光RT-PCR方法、CSFV鑒別熒光MGB-RT-PCR方法和CSFV RT-nPCR方法，病原檢測結果與歐盟完全一致;采用本實驗室建立的CSF抗體間接ELISA和阻斷ELISA方法，僅間接ELISA對一個盲樣反應結果為陰性或可疑，其余樣本完全符合。3次國際比對、國內比對以及我們的大量實驗結果顯示，中監所研制的系列方法彌補了我國CSF病原檢測的空白，組裝的CSF病原檢測試劑盒相關指標達到歐盟參考實驗室技術標準，抗體檢測試劑盒相關指標達到了進口商品化試劑盒的標準。可實現CSF病原檢測和CSF抗體檢測試劑盒的國產化，提升我國CSF診斷水平，為獲得國際貿易認可鋪平了道路，具有很好的推廣應用前景和極大的產業化價值。

通過和歐洲的交流及合作，提升了科技創新能力，解決CSF準確診斷的關鍵問題，建立了良好的國際合作渠道，提升了該實驗室的國際地位，建立并完善我國系列CSF診斷技術，進而改進和完善我國CSF預防控制策略。至此，我們在CSF診斷、疫情監測、分子流行病學調查分析等所需的檢測方法已經系統建立，已經成為國內建立和掌握CSF診斷技術最全的實驗室之一。

4 標記疫苗的研究

由于HCLV接種豬與自然感染豬不能從血清學上予以區分，我國CSF防控實行的是強制免疫措施，開發CSF標記活疫苗對于我國CSF凈化和參與國際貿易具有現實意義。本實驗室運用反向遺傳操作技術，在C株感染性克隆的E1 C末端插入FLAG基因作為標記分子，構建了含有FLAG標記的vC-FLAG病毒。細胞適應性實驗證明vC-FLAG病毒可以適應多種豬源細胞，SK6細胞系是培養vC-FLAG的最適細胞系。不同代次病毒經免疫組化、RT-PCR和核苷酸序列測定證明嵌合病毒能穩定表達標記抗原，且在細胞中傳代的遺傳穩定性良好，為CSF標記疫苗研究奠定了基礎。

5 豬瘟凈化策略研究

CSF是我國政府計劃要根除的重要傳染病，通過“十一五”支撐計劃《豬瘟、豬偽狂犬病綜合防空集成與示范》的實施，集成上述技術，按照準備階段→控制階段→強制凈化階段→監測階段→認證階段等五個凈化程序，通過對CSF快速診斷試劑盒、疫苗毒株和致病毒株鑒別診斷方法的篩選和整合，免疫程序的調整，生物安全措施的綜合實施。對CSF嚴重污染場，CSF病原陽性率分別從2006年的7.08% ～11.49%下降至 2010年的0% ～2.07%，達到基本清除CSF的目標;對CSF一般污染場，陽性率分別從0.87% ～3.09%下降至0%，清除CSF。CSF免疫合格率總體上升，從2006年的67.30% ～90.67%上升至2010年的 85.00% ～96.32%。達到了基本無疫或無疫，成功在15個規模化養豬示范場使7個場凈化了CSF，示范場生產指標得到了全面改善，經濟效益穩步提升，提升了養豬場的理論水平和疫病防控能力。構建了符合我國國情的規模化豬場CSF和豬偽狂犬病的不同凈化模式，形成了一系列的指導方案，制定了《規模化豬場豬瘟、豬偽狂犬病綜合防控技術集成與示范實施方案》、《規模化豬場豬瘟凈化技術指南》、《集約化、規模化豬場生物安全體系的實施方案》和《“豬瘟、豬偽狂犬病綜合防控技術集成與示范”課題種豬凈化認證方案建議》等指南，取得的重要創新性成果，可用于指導我國CSF的防控和凈化。

CSF困擾我國養豬業已經半個多世紀，目前依然是各級政府計劃要根除的重大豬病。上述研究表明CSF的病毒基因組比較穩定，且只有一個血清型，對該病毒的清除是一個有利條件。同時本實驗室研發的診斷技術已經達到國際技術標準，并被國際上認可。尤其是“十一五”期間對我國部分養豬場凈化CSF的成功先例表明，在我國目前豬病流行狀態下，在規模化豬場和部分區域開展CSF的凈化是完全可行的。

致 謝: 感謝軍事獸醫研究所涂長春教授，中國動物與衛生流行病學中心黃保續教授及英國AHVLA Trevor Drew教授給予的幫助。

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