果膠酶法提取番茄總皂苷的工藝研究

陳思呈，劉金磊，盧鳳來，李典鵬*

(1.廣西壯族自治區中國科學院廣西植物研究所，廣西桂林541006;2.廣西師范大學生命科學學院，廣西桂林541004)

番茄Lycopersicon esculentum Mill.為茄科番茄屬植物，原產南美洲，我國各地均普遍栽培。番茄皂苷為番茄中水溶性成分，而番茄紅素為番茄中脂溶性成分，在加工生產番茄紅素過程中，往往需要脫水而將番茄皂苷白白損失浪費掉。目前國內還很少有番茄皂苷的研究報道，日本的研究人員在番茄皂苷的理化性質及藥理活性方面進行了深入而廣泛的研究，并證明番茄皂苷尤其是主要成分番茄皂苷A(esculeoside A)具有多種生理和藥理活性，其在降血脂及抗動脈粥樣硬化方面具有獨特的作用［1-2］。

目前國內外尚未見番茄皂苷提取工藝的研究報道。選用適當的酶作用于藥用植物材料，破壞細胞壁的致密構造，有利于有效成分的溶出，以提高目標物質的得率［3］。果膠酶(pectinase)是能夠分解果膠物質的多種酶的總稱［4］，果膠酶作用于果膠質中D-半乳糖醛酸殘基之間的糖苷鍵，使高分子的聚半乳糖醛酸降為小分子物質［5］。本實驗首次建立了番茄總皂苷果膠酶酶解的工藝，為進一步研究番茄皂苷提供了依據。

1 試藥與儀器

1.1 實驗儀器Agilent1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司);2000ES蒸發光散射檢測器(美國Alltech公司);安捷倫化學工作站(美國Agilent公司);R-3旋轉蒸發儀(瑞士步琪有限公司);TL-5.0臺式離心機(上海市離心機械研究所);TP-2200B電子天平(湘儀天平儀器設備有限公司);METTLER AT200分析天平(上海涵今儀器儀表有限公司);B3500S-MT超聲清洗器(必能信超聲有限公司);L-550離心機(湘儀離心機儀器有限公司);Christ Alpha 1-2實驗室高級凍干機(德國Martin Christ公司);MILLIPORE Simplicity超純水器(上海人和科學儀器有限公司);果汁機(九陽股份有限公司)。

1.2 實驗材料新鮮成熟櫻桃小番茄，購自桂林資源縣番茄種植基地;自制番茄皂苷A標準品(經核磁共振譜1HNMR，13C-NMR鑒定其結構，HPLC-ELSD法測定得出純度為98.9%)。

1.3 化學試劑果膠酶(型號:PP-3，天津利華酶制劑技術有限公司);甲醇(美國TEDIA公司，色譜純);重蒸蒸餾水(自制);超純水(自制);去離子水(自制)。

2 方法與結果

2.1 番茄皂苷A的測定番茄皂苷A在HPLC-ELSD檢測法中顯示其相對含有量占總皂苷的很大的部分，其它皂苷類物質則含有量很低［6］，因此后續大部分工藝環節主要以番茄皂苷A為考察指標。同一批次番茄打漿酶解后直接通過測定番茄皂苷A的濃度來評價工藝參數，可以減少過多的后續操作帶來計算結果上的誤差。番茄中的皂苷主要為甾體皂苷，而由于甾體皂苷具有無紫外吸收或吸收極弱的特點，其檢測存在很大的困難［7］，目前據文獻報道的、蒸發光散射檢測已經成功地應用于酸棗仁皂苷、人參皂苷、黃芪皂苷等的定量分析與檢測［8］。因此對其測定方法及條件進行了研究。

2.1.1 番茄皂苷A標準品的配制精密稱取10.00 mg番茄皂苷A標準品，用50%甲醇水溶液(在此濃度的溶劑中有最好的溶解度)定容到50 mL，配置成質量濃度為0.2 mg/mL，即0.2 μg/μL的番茄皂苷A標準品溶液。

2.1.2 色譜條件的確立色譜柱:ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);柱溫:30℃;流動相:甲醇-水(梯度洗脫:0→5 min:20%→40%甲醇;5→10 min:40%→60%甲醇;10→20 min:60%→80%甲醇);檢測時間:20 min;后運行時間:5min;流動相體積流量:0.8 mL/min;ELSD檢測器參數:漂移管溫度:100℃。空氣:2.7L/min。見圖1。

圖1 對照品和樣品的HPLC色譜圖

2.1.3 標準曲線的制備依次精密吸取0.6、1.2、1.8、2.4、3.6、4.2 μg的標準品溶液，以進樣量(μg)的常用對數值為橫坐標，峰面積積分值的常用對數值為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。回歸方程為:Y=1.697 4X+5.717 3，R2=0.999 6。番茄皂苷A在0.6～4.2 μg范圍內有良好的線性關系。

2.1.4 精密度實驗標準品溶液連續進樣6次，每次15 μL，記錄峰面積，計算峰面積及相當于番茄皂苷A質量的RSD值，其中峰面積RSD為1.01%，番茄皂苷A質量RSD為0.61%，結果表明，儀器精密度良好。

2.1.5 穩定性實驗精密稱取粗皂苷粉末102.00 mg，定容至50 mL，0～10 h分別檢測，記錄峰面積，計算峰面積及質量的RSD值。其中峰面積RSD為2.95%，番茄皂苷A質量RSD為1.73%，結果表明，供試樣品在10 h內穩定。

2.1.6 重復性實驗精密稱取6份粗皂苷粉末，每份100 mg，定容至50 mL，檢測并記錄峰面積，計算峰面積及質量的RSD值。其中峰面積RSD為2.17%，番茄皂苷A質量RSD為1.31%，結果表明，供試樣品重復性良好。

2.1.7 加樣回收率實驗精密稱取4份測定過番茄皂苷A含有量的粗皂苷粉末，每份約100 mg。精密稱取番茄皂苷A標準品4份，每份2 mg，分別加到4份樣品中，最后定容到50 mL。檢測峰面積，求算回收率、平均回收率和RSD值。平均回收率為96.03%，RSD為0.41%，結果表明實驗方法準確度較高，符合測定要求。

2.2 酶解單因素實驗

2.2.1 酶添加量對酶解效果的影響將番茄打成勻漿，精密稱量9份，每份1 kg，放入燒杯中，分別加入相當于鮮果質量0.0、0.1‰、0.2‰、0.3‰、0.4‰、0.5‰、0.6‰、0.7‰、0.8‰的果膠酶，在50℃條件下恒溫酶解2.0 h，立即取出離心，液相檢測其中番茄皂苷A的峰面積，計算其質量濃度，平行2份，結果取平均值。由圖2可知，隨著添加酶量的增加，開始時清液中番茄皂苷A質量濃度逐漸升高，超過0.5‰后逐漸下降。有文獻報道果膠酶制取總皂苷相關工藝，分析其中的原因可能是，當繼續加大酶量，底物濃度不能對酶達到飽和，導致酶的作用受到抑制，造成皂苷得率下降［9-10］，孟碩等實驗證明單一果膠酶對苷鍵亦有一定的水解作用［11］。實驗用的果膠酶，其中可能存在一些競爭性抑制因子，則會抑制果膠酶與底物的結合，雜質糖苷酶的存在也會造成皂苷類物質糖苷鍵的水解。但是一定量果膠酶的加入，增加了番茄漿的澄清度和可過濾性，使得后續的離心及過柱更簡便易行［12］，因此選定最佳酶加入量為0.4‰。

圖2 酶添加量對番茄皂苷A質量濃度影響

2.2.2 酶解反應溫度對酶解效果的影響將番茄打成勻漿，精密稱取7份，每份1 kg，放入燒杯中，加入0.4‰果膠酶，在35、40、45、50、55、60、65℃條件下恒溫酶解2 h，離心，檢測上清液中番茄皂苷A峰面積，并計算其質量濃度。由圖3可知，當酶解溫度達到50℃時，番茄皂苷A的質量濃度達到最高。

圖3 酶解溫度對番茄皂苷A質量濃度影響

2.2.3 酶解反應pH值對酶解效果的影響將番茄打成勻漿，精密稱取7份，每份1 kg，放入燒杯中，pH值分別調到2.5、3.0、3.75(番茄汁自身pH值)、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0(調到7.0時顏色突然變深)。加入0.4‰果膠酶，在50℃條件下恒溫酶解2 h，離心，檢測上清液中番茄皂苷A峰面積，并計算其質量濃度。由圖4可知，當酶解pH值為3.75～5.0時，酶解液中番茄皂苷A質量濃度最大。

圖4 酶解pH值對番茄皂苷A質量濃度影響

2.2.4 酶解反應時間對酶解效果的影響將番茄打成勻漿，精密稱取7份，每份1 kg，放入燒杯中，加入0.4‰果膠酶，在50℃，pH4.0下，分別酶解0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h，每份酶解液取出后，立即離心，檢測上清液中番茄皂苷A峰面積，并計算其質量濃度。由圖5可知，當酶解時間達到2 h時，酶解液中番茄皂苷A質量濃度達到最大。

圖5 酶解時間對番茄皂苷A質量濃度影響

2.3 番茄酶解正交實驗考慮到以上酶解單因素對番茄皂苷A提取效果均有不同程度的影響，并且4個單因素之間存在著交互的作用。因此，選取這4個單因素，在3個不同水平上，按照L9(34)正交表設計正交實驗。

2.3.1 正交因素與水平的設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計

2.3.2 正交實驗結果及方差分析見表2，表3。

表2 正交試驗結果與分析

表3 方差分析

由極差分析及方差分析可知，酶解法制得番茄清液中，番茄皂苷A質量濃度或得率的影響因素主次順序為:C＞D＞A＞B，即影響酶解法中番茄皂苷A質量濃度的因素依次是:酶用量＞酶解pH＞酶解溫度＞酶解時間。其中在所選定的3個水平下，酶添加量對番茄皂苷A的質量濃度影響比較顯著。

因此確定酶解法最佳提取條件為:A3B2C2D2，即最佳提取工藝為:酶解溫度55℃，酶解時間2 h，酶添加量0.4‰，pH4.0。

2.4 酶解工藝的驗證實驗精密稱取同一批次西紅柿6份，每份45 kg，分為加酶組和不加酶組，每組3份，加酶組機器打漿后按優選出的最佳工藝條件進行酶解，并經過大孔樹脂吸附制取總皂苷。另一組不加酶，機器打漿后直接離心過大孔柱吸附制取總皂苷。結果見表4，加酶組所得總皂苷平均得率為0.25%，明顯高于不加酶組的0.14%。并且在實驗中發現，不加酶組所得番茄汁含有大量絮狀細胞團，給離心及過柱帶來了極大困難。此外，由于番茄水分經冷凍干燥法測定高達90%以上，在大生產中若采用溶劑提取法則很難實現，綜合考慮成本及可操作性，果膠酶法明顯優于其他提取法。

表4 不同提取法總皂苷得率比較

3 分析與討論

3.1 番茄果實含水量高，經測定在90%以上，若采用溶劑提取法則操作困難，成本必將很高。為使工藝過程更為高效而低成本，首先采用機械破碎的方式使大量細胞破壁促進內含物充分釋放。機械破碎后得到的番茄漿黏度大，且存在大量未被充分破碎的細胞。為了使番茄細胞充分破碎及分離以提高番茄皂苷的得率及后續的過柱性能，本實驗設計采用果膠酶法并優化其條件，實驗證明酶解工藝是高效可行的。

3.2 通過對影響酶解效率的4個因素進行單因素實驗，在單因素的基礎上對這4個單因素在3個水平上，按照L9(34)進行正交設計，實驗平行2份，對結果進行直觀分析及方差分析，得出最佳酶解工藝條件為:酶解溫度55℃，酶解時間2 h，酶添加量0.4‰，pH4.0。其中在所選定的3個水平下，酶添加量對番茄皂苷A的質量濃度影響比較顯著，因此在實際生產中，對果膠酶的用量要嚴格控制。

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