提高腦組織冰凍切片質量的幾點體會①

李 慧 黃景陽 袁中瑞 (山東大學醫學院病理生理學教研室，濟南250012)

冰凍切片因操作簡便、快捷、環境污染小(無須用二甲苯處理)，組織抗原損傷小而被許多臨床和科研工作者所應用[1]，但冰凍切片主要有兩個問題，第一:冰凍切片比較容易脫片，給后續免疫組化過程帶來了很大的麻煩與不便。脫片是指組織從載玻片上脫下或組織已與載玻片分離，懸浮但尚未脫下。載玻片的處理方式及操作者切片的熟練程度等都能影響冰凍切片的脫片情況，這些因素會使冰凍切片在免疫組織化學染色過程中脫片不一，切片可能只是邊緣輕度卷曲，也可能是不同面積的脫落甚至是完全脫片;第二:冰凍切片是否需要抗原修復的問題至今尚無定論，這兩點使冰凍切片的染色質量、結果準確性下降，因此造成最終實驗結果可比性差。為保證實驗的正確性和科學的嚴謹性，冰凍切片的脫片情況和是否需要抗原修復的問題急需解決。腦組織冰凍切片使用率高，眾多處理方法更是值得推敲，但是腦組織冰凍切片的脫片情況并沒有完全解決，本文將現有的腦組織冰凍切片技術結合自己在腦組織切片過程中所遇到的問題進行探討，主要從載玻片處理、組織灌流固定、腦組織冰凍切片、免疫組織化學染色四個部分探討在保證實驗真實性和科學性的前提下，提高免疫組織化學染色結果的準確性。

1 載玻片處理過程注意事項

在臨床病理診斷和鑒別診斷中，比如說對于外科切下的腫瘤等，D'Halluin等[2]將乳腺腫瘤的邊緣組織冰凍切片后直接貼在普通載玻片上，快速檢測組織的良惡性后，將信息反饋給外科大夫來指導下一步手術，這樣的方法被部分臨床病理診斷所使用，其操作時間短并且步驟簡單，所以不易出現組織脫片情況，但是這種方法不能普遍應用于全部基礎實驗和臨床病理診斷中，不處理的玻片直接使用，組織脫片情況非常嚴重，甚至會造成研究的中斷，而直接購買已經處理過的玻片不僅價格昂貴，而且處理效果不一致，所以多數研究人員選擇自己處理玻片。

1.1 溶液配制 現用于免疫組化染色的防脫片劑有多種類型，如明膠、多聚賴氨酸、乳白膠、APES(氨醛三已氧基硅烷)、蛋白甘油、試劑公司提供的切片等等[3，4]，其中以明膠和多聚賴氨酸的使用率最高。多聚賴氨酸價格昂貴，不適合大批量使用，會給實驗工作人員帶來不必要的經濟負擔。使用相同的防脫片劑但是使用不同的處理方法，如只單純改變防脫片劑的涂片次數來處理載玻片，也會使后續免疫組化過程中組織脫片情況不同[5]。我們在實驗過程中將于德欽等[3]的方法略做改進后來處理玻片，具體方法如下:①稱取明膠2.5 g，溶于500 ml蒸餾水中，水浴箱加熱溶解。此過程中水浴箱溫度設定不超過60℃，因明膠本身為一種蛋白質，不采用水浴加熱則不易溶解，若采用微波等方法加熱，溫度則不易控制，很容易導致明膠失活和涂片不均勻。②明膠完全溶解后向上述溶液加入0.25 g硫酸鉻鉀(別稱鉻明礬)。因硫酸鉻鉀密度較大，溶解后容易沉在全部溶液的下半部分，用時需混勻，因加入的硫酸鉻鉀較少，此問題易被忽視，故在硫酸鉻鉀溶解過程中，可吹打溶液促溶硫酸鉻鉀，這樣亦可起到混勻溶液的作用，溶液配制完成后室溫放置。明膠硫酸鉻鉀溶液使用期限最好不超過一周，因為明膠為一種蛋白質，放置較長時間后該溶液易長菌變質，溶液霉變或溶液由淡黑綠色變成褐色時嚴禁使用。在處理玻片前應仔細觀察溶液是否霉變(霉變后有絮狀物)、是否變色，一般只需注意在處理玻片時，保證玻片干凈無水，不將該溶液稀釋，并在該溶液不變質的情況下可以連續使用。

1.2 玻片處理 將新購未處理的載玻片擺置在干凈的玻片架上，在蒸餾水中沖洗數秒，目的是除去玻片生產過程中的粉塵及空氣中飄粘上的毛絮，60℃烤箱中烤干或密封箱子內涼干玻片上的蒸餾水，此為保證玻片干凈和明膠硫酸鉻鉀溶液不被稀釋。將上述處理好的玻片浸入配好的明膠硫酸鉻鉀溶液中30秒，其間可輕輕擺動玻片架，使玻片涂抹均勻，室溫涼干玻片，放于60℃烤箱中烤12～24小時，該過程注意載玻片須控盡液體或室溫完全晾干后才可置入烤箱中烤干備用。

2 灌流固定過程注意事項

2.1 灌流固定原理 組織固定的原理主要是在不影響酶、抗原活性的情況下固定液快速滲入組織內，使蛋白質快速凝固，阻斷細胞的新陳代謝，而對糖原、核酸和碳水化合物起到保護作用。常用的冰凍切片的固定液有6種:95%酒精、4%甲醛、甲醇、丙酮、EAF固定液、AAF固定液。邱前程等[6]認為對于多數抗體而言，EAF固定液的固定效果要優于其他固定液，但是個人認為不同的固定液固定組織有不同的原理，絕不可一概而論。95%酒精穿透性強，可使蛋白質變性而固定組織，兼有脫水的作用;4%多聚甲醛與10%福爾馬林作用原理類似，主要是與組織內的氨基酸殘基在分子內或分子間形成醛鍵，使蛋白質相互交聯而固定組織;甲醇的機理主要是使蛋白質變性;丙酮滲透力強，使蛋白質沉淀，其多用來固定細胞而很少用于固定組織;EAF、AAF主要為幾種單純固定液的混合液配合緩沖液組成，并且加入冰醋酸以促染色，所以此二者雖然可以應用于多數組織的固定，但由于不同組織組成成份(蛋白質、脂肪、核酸、糖原等的構成比例)不同，使用這兩種固定液的固定效果也不同，不可一概而論。不同的固定液都有不一樣的優缺點，需要根據自己實際過程中所用的組織，后續不同的需要來選擇不同的固定液。

2.2 灌流固定方法 高永強等[7]認為在腦組織冰凍切片時，4%多聚甲醛心臟灌流固定的效果優于其他方法，我們在實驗過程中將此方法進行改進:①多聚甲醛固體不易溶解，用1×PBS配制的多聚甲醛溶解后，用約90 μm孔徑的定性濾紙過濾溶液，以減少在后續免疫熒光染色中因多聚甲醛顆粒造成的非特異發光。②多聚甲醛配制完成后，4℃保存，此時多聚甲醛揮發少，并可被提前預冷，使灌流固定效果優良[8，9]，1周之內用完。③NS 置換血液和多聚甲醛灌流固定組織時，灌流管中都不應有氣泡，否則會造成空氣栓塞，影響灌流固定效果。④NS灌流置換血液時，灌流管的長度不宜過長，1 m的高度即可，否則由于NS的重力和灌流速度過快會使灌流液體的壓力過大，造成微小血管破裂而影響灌流效果。⑤李晶晶等[10]認為多聚甲醛灌流固定時速度先快后慢的方式可以提高組織固定效果。我們在實際實驗中用三通管來操作，將用來灌流的尖端磨平的針頭從大鼠左心尖插入大鼠主動脈根部，固定針頭后開始NS灌流，待流出的NS的灌流液澄清后說明動物體內的血液基本被完全置換，在用三通管換成多聚甲醛灌流固定前，事先用100 ml的注射器(不帶針)抽取大約60 ml 4%多聚甲醛，待 NS將血液置換完全后，將連接多聚甲醛用來灌流固定的輸液器從藥液過濾器與輸液針(灌流固定針)之間的連接件處分開輸液器，將100 ml的注射器與輸液針相連，把事先抽好的60 ml 4%多聚甲醛快速推注動物體內，之后分開注射器與輸液針，再將連接多聚甲醛的輸液器從藥液過濾器處與輸液針連接，之后滴注多聚甲醛約1小時。該過程需保證NS將動物體內的血液全部置換后，方可用多聚甲醛固定，否則殘存的紅細胞會造成非特異染色，從而影響免疫組化染色結果的準確性;還需保證多聚甲醛的灌流速度先快后慢，這樣組織固定效果優良。取出腦組織后將腦組織浸泡在4%多聚甲醛中，4℃過夜。組織固定完成后，將組織在4℃冰箱用20%、30%的蔗糖梯度脫水，待組織塊沉底后取出。組織脫水所用的蔗糖溶液的體積須大于所脫水組織體積的5倍才可達到比較好的脫水效果，蔗糖溶液體積過小會使脫水不充分，導致切片時產生數目較多、體積較大的冰晶，最終表現在免疫組化染色圖片上則是無數空洞，從而影響免疫組化染色結果的準確性。

3 切片過程注意事項

3.1 冰晶問題 切片時要防止冰晶產生，冰晶是由腦組織脫水后殘存的水分子結冰形成[1]。從水的物理性質中可以看出，水在-4℃時體積最大，這意味組織在-4℃停留時間越長，組織內產生的冰晶體積越大、數量越多，因此要最短時間內使組織溫度降至-4℃以下。水、脂肪和蛋白質的物理性質決定了在溫度同時下降時，水最容易從液體狀態轉化為固體狀態，即在腦組織中結冰成冰晶，冰晶質地硬，若此時腦組織內的主要成份脂肪和蛋白質因沒有完全凍結而質地較軟，冰晶形成后便會擠壓冰晶周圍組織，使組織受壓變形，所以必須使腦組織快速降溫，保證水、脂肪和蛋白質都在最短的時間內充分凍結。在免疫組織化學染色中，冰晶可以融化，但腦組織受壓變形后卻不能恢復，此時便會在腦組織冰凍切片上形成大小不一的間隙，表現在免疫組化染色圖片則是一個個大小形態不一的空洞。免疫熒光染色的目的主要是觀察熒光的亮度與強度，背景色一般為黑色，空洞在背景中因色暗而容易被忽視;而用DAB顯色的免疫組化圖片背景色一般為無色透明或淺色，此時在圖片上便會有無數空洞，常影響實驗結果的觀察和分析[11]，所以在腦組織冰凍切片時要注意速凍腦組織。包翠芬等[1]認為用液氮驟冷法來速凍腦組織效果好，但是該方法在具體操作時，要注意液氮的使用方式，否則會使腦組織因冰凍不均勻而破裂，可以在腦組織周圍裹適量OTC膠后，再在樣品上澆液氮或者將樣品連帶樣品托放入液氮中，這樣既可防止腦組織因冰凍不均而產生裂痕又可達到較好的速凍效果。

3.2 包埋 包埋時要盡量防止氣泡產生，包埋時存在氣泡會造成包埋不均勻，在切片時因氣泡與OTC膠質地不同，所切的腦片容易從氣泡周圍開始卷曲;包埋后須把OTC膠修成長方形、正方形或是梯形，保證所切的腦片周邊沒有小的尖刺，切片周邊小的尖刺或切片形狀不規則都容易使切片從這些不規則的地方開始卷曲。

3.3 固定樣品托與切片 牢固固定樣品托，雖然現在冰凍切片機結構良好，但是這個問題容易被操作者忽視，若樣品托固定不牢固或有轉動的情況，由于腦組織重力和刀片的相互作用會使切片成弧形而造成貼片不完全，切片時要先慢后快，先慢為使刀片切力小，使腦片不容易卷曲，后快為使所切的腦片遠離刀片邊緣，使得貼片容易。組織標本最好一次性切完，因組織抗原通常是一種蛋白質，反復凍溶組織會損傷組織抗原;而且被反復凍融的組織會變脆甚至性狀發生改變，從而使切片和貼片困難，使組織更易出現脫片情況。

3.4 貼片 可在載玻片上滴3 μl左右的PBS后貼片，以所滴的PBS為起點輕輕沾起腦片，該過程要防止氣泡產生，個人認為數目不多且直徑小于1 mm的氣泡對后續DAB顯色的普通免疫組化和免疫熒光結果影響不大;大的氣泡可以用軟毛筆將其戳破，對后續實驗幾乎無影響。

3.5 儲存 貼片完成后，需室溫待載玻片上的PBS涼干后，將腦切片放入-80℃冰箱中備用，否則殘留的PBS會在玻片與腦片間結冰，導致免疫組化過程中易出現脫片現象。剛剛切好的冰凍切片不宜馬上作免疫組化，容易出現脫片，可能是因為明膠這種蛋白質與硫酸鉻鉀形成的膠狀混合物涂在載玻片上后，再與富含脂肪的腦片黏合需要一定的時間，切片完成后放于-80℃冰箱2至3天后，待腦片與玻片黏合充分后，再做免疫組化則不易出現脫片。切片放置時間不宜超過一個月，否則會影響冰凍切片上的抗原。

4 免疫組織化學染色過程注意事項

4.1 是否需要抗原修復的問題 目前認為影響抗原修復的兩個基本因素是:抗原修復溫度和修復液的pH值，抗原修復技術的發明主要歸功于生物化學家對蛋白質與甲醛化學反應的深入研究[12]。杜鵑等[13]用10%的中性多聚甲醛固定前列腺癌、良性前列腺增生、乳腺增生組織和人乳頭狀瘤病毒感染的外陰上皮組織，之后研究 P504S、P63、CD10、Ki-67抗原在不同的溫度和PH溶液中的修復情況，發現不同的抗原有不同的修復條件。因為蛋白質分子與甲醛反應的復雜性，故難以找到一種適合所有組織抗原修復的方法，而抗原修復的主要機制是打開甲醛與蛋白質分子形成的交聯物。以前認為冰凍切片進行免疫組織化學染色時不需要抗原修復，現多數實驗人員也沒有將抗原修復技術應用于冰凍切片，但是Yamashita等[14]將抗原修復技術應用于甲醛固定的新鮮組織的冰凍切片，獲得了優良的免疫組織化學染色;李娟娟等[15]認為用福爾馬林固定大鼠腦組織進行冰凍切片時，許多抗原決定簇會被醛基交聯封閉，其采用高溫高壓的方法修復抗原，效果良好;于彬等[16]將微波修復法應用于腦組織冰凍切片的抗原修復，效果亦良好;Krenacs等[17]發現在合適的緩沖液中，用大于95℃的濕熱修復法能打開在福爾馬林固定過程中產生的蛋白質醛基交聯，重塑組織抗原表位的原有結構;Hasui等[18]用熱修復抗原法對成人外周血單核細胞的p53蛋白進行免疫組織化學染色，染色效果亦較好。由于蛋白質分子與甲醛反應的復雜性，所以不同抗原的修復方法也各異，這就給實驗造成了一定難度，并且抗原修復會不會產生假陽性結果的問題至今尚無定論。個人認為在具體的實驗過程中若懷疑有假陽性結果，必要的情況下可以選擇陰性對照和陽性對照同時做免疫組化，以此也可確定是否因抗體造成的實驗結假陽性;再者實驗前需就靶抗原進行基本了解，確定其核漿表達情況等也有助于判斷實驗結果是否假陽性。我們在實驗過程中采用4%多聚甲醛心臟灌流固定，因多聚甲醛較10%福爾馬林性溫和，在免疫組織化學染色時未進行抗原修復，我們在排除了假陽性情況后，也得到了預期的陽性結果，所以在實驗中不管冰凍切片修復與否，及不管采用什么樣的修復方式，在同一個實驗前后最重要的是保證實驗條件的一致性，以便進行實驗結果比較，這樣才能保證實驗的科學性、嚴謹性和真實性。

4.2 洗片 腦組織冰凍切片洗片過程動作要輕柔，不宜用移液管或移液槍正對腦片直接沖洗，如果腦片貼片時有空泡或切片周邊有輕微脫片，直接沖洗易造成整個腦片脫片。操作時可從腦片周邊的載玻片開始沖洗，或者用載玻片立式缸浸泡玻片，我們實驗中采用:立式缸內，1×PBS/TBST浸泡腦片20分鐘×3次的洗滌方法取代傳統搖床洗滌5分鐘×3次的洗滌方法，浸泡期間時常晃動立式缸即可，此法起到了優良的洗滌效果，有效得避免了組織脫片，提高了實驗的準確性。

石蠟切片雖然容易操作并且儲存方便，但由于石蠟切片對組織結構和抗原損傷破壞大，組織抗原性下降，使石蠟切片在一些分子生物學實驗方面(如研究組織表面抗原和細胞分泌蛋白等)受到限制[19]，石蠟切片會用到二甲苯，二甲苯對環境污染嚴重，并會損害實驗人員身體健康，冰凍切片的這些問題則很少。冰凍切片的主要問題是脫片和抗原修復問題，故本文從明膠硫酸鉻鉀處理載玻片、腦組織灌流固定、腦組織冰凍切片、免疫組織化學染色等四大部分探討如何減少腦組織冰凍切片脫片;如何提高腦組織冰凍切片免疫組化染色結果的準確性。我們結合現有的腦組織冰凍切片技術和我們在實驗過程中的不斷總結，選擇了廉價的明膠來處理載玻片，減少了腦冰凍切片脫片;預冷的多聚甲醛灌流固定，提高組織灌流固定效果，我們所選的試劑價格低廉，配制方法簡捷，用量少，重復性好，并且染色結果準確性高，尤其是明膠處理的載玻片在免疫組化實驗中都可使用，尤其適合大批量使用，可在臨床和科研實驗室中積極推廣。

1 包翠芬，劉 霞，穆長征et al．冰凍切片幾種防冰晶方法的比較[J].中國誤診學雜志，2006;6(17):3310-3311.

2 D'Halluin F，Tas P，Rouquette S et al．Intra-operative touch preparation cytology following lumpectomy for breast cancer:a series of 400 procedures[J].Breast，2009;18(4):248-253.

3 于德欽，田余祥，陳 熙et al．明膠硫酸鉻鉀在腦組織冰凍切片中的防脫片作用[J].大連醫科大學學報，2009;3l(5):616-617.

4 虞 杰，顧冬梅，郭臨川.防脫片劑在免疫組織化學染色中的應用[J].中國血液流變學雜志，2008;18(3):432-433.

5 唐 潔，侯 潔，韓麗枝 et al．免疫組化染色防脫片幾種方法的比較[J].中國組織化學與細胞化學雜志，2005;14(3):358-360.

6 邱前程，盧善明，黃杰雄.不同固定劑對冰凍切片免疫組化結果的影響[J].分子診斷與治療雜志，2009;1(4):250-252.

7 高永強，楊巧蓮，王 偉.大鼠局灶性腦缺血模型制備及取腦方法實驗研究[J].包頭醫學院學報，2009;25(4):6-9.

8 姚斌偉，高亞兵，董 霽et al．腦組織灌注固定脫水后去除冰晶方法的建立及其在微波輻射致腦損傷中的應用[J].軍事醫學，2011;35(5):394-396.

9 陳廣斌，謝 玲，林堅濤.不同固定方法對新生大鼠腦組織切片的影響[J].中國民康醫學，2008;20(15):1730-1731.

10 李晶晶，朱 鴻，施彩虹.三種方法對大鼠視網膜固定效果的比較研究[J].上海交通大學學報(醫學版)，2011;31(8):1105-1107.

11 田玉旺，丁華野，李 琳et al．一種減少冰凍切片組織內冰晶處理方法[J].臨床與實驗病理雜志，2002;18(5):567-568.

12 Shi S R，Cote R J，Taylor C R.Antigen retrieval immunohistochemistry and molecular morphology in the year 2001[J].Appl Immunohistochem Mol Morphol，2001;9(2):107-116.

13 杜 娟，石雪迎，鄭 杰et al．抗原修復液pH值及修復時間對免疫組化染色效果的影響[J].北京大學學報(醫學版)，2005;37(2):195-197.

14 Yamashita S，Okada Y.Application of heat—induced antigen retrieval to aidehyde—fixed fresh frozen sections[J].J Histochem Cytochem，2005;53(11):1421-1432.

15 李娟娟，于建云，郭澤云et al．防止冰凍切片在抗原修復過程中脫片的實驗技術改進[J].昆明醫學院學報，2007;5(28):145-146.

16 于 彬，孫 榆，何揚濤.微波修復在冰凍切片免疫組化中的應用[J].四川解剖學雜志，2001;9(1):59-61.

17 Krenacs L，Krenacs T，Stelkovics E et al．Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections[J].Methods Mol Biol，2010;588:103-119.

18 Hasui K，Wang J，Tanaka Y et al．Development of ultra-super sensitive immunohistochemistry and its application to the etiological study of adult T-cell leukemia/lymphoma[J].Acta Histochem Cytochem，2012;45(2):83-106.

19 Braun M，Menon R，Nikolov P et al．The HOPE fixation technique--a promising alternative to common prostate cancer biobanking approaches[J].BMC Cancer，2011;11:511.