風濕免疫臨床實驗的實習教學體會

張文蘭 胡同平 (包頭醫學院第一附屬醫院，包頭014010)

風濕免疫病學是一門較新的臨床醫學學科，起步較晚，人們對風濕免疫性疾病的認識尚淺，易引起漏診、誤診。風濕免疫性疾病指主要侵犯關節、肌肉、骨骼及關節周圍的軟組織，如肌腱、韌帶、滑囊、筋膜等部位的病。在臨床實驗的實習帶教中，筆者認為應從以下四個方面讓學生對風濕免疫有更全面的了解。

1 要讓學生了解風濕免疫性疾病的范疇和分類[1]

風濕免疫性疾病是一組疾病，包括彌漫性結締組織病(類風濕關節炎、紅斑狼瘡、硬皮病、多肌炎、重疊綜合征、血管炎等)、脊柱關節病(強直性脊柱炎、Reiter綜合征、銀屑病關節炎、未分化脊柱關節病等)、退行性變如原發性和/或繼發性骨關節炎、與代謝和內分泌相關的風濕病(痛風、假性痛風、馬方綜合征、免疫缺陷病等)、和感染相關的風濕病(反應性關節炎、風濕熱等)、腫瘤相關的風濕病(原發性的滑膜瘤、滑膜肉瘤等，繼發性的多發性骨髓瘤、轉移瘤等)、神經血管疾病(神經性關節病、周圍神經受壓和/或神經根受壓等引起的壓迫性神經病變、雷諾病等)、骨與軟骨病變(骨質疏松、骨軟化、肥大性骨關節病、彌漫性原發性骨肥厚、骨炎等)、非關節性風濕病(關節周圍病變、椎間盤病變、特發性腰痛、其他痛綜合征如精神性風濕病等)、其他有關關節癥狀的疾病如周期性風濕病、間歇性關節積液、藥物相關的風濕綜合征、慢性活動性肝炎等。

2 要讓學生對風濕免疫性疾病的自身抗體有全面的了解

隨著醫學的不斷發展和進步，出現了越來越多的自身抗體。這些自身抗體的出現，對于風濕免疫性疾病的診斷和鑒別診斷，起到了非常重要的作用。

2.1 抗核抗體 抗核抗體(Antinuclear antibodies，ANA)是抗細胞核抗原成分的自身抗體的總稱，是一組針對細胞核內DNA、RNA、蛋白質、脂類、酶類或這些物質的分子復合物的抗體。已證實，ANA對很多自身免疫性疾病有診斷價值。在不同疾病中，特別是風濕免疫性疾病，其抗體譜有一定的特異性。在炎癥性風濕病中ANA陽性率在20% ～100%，其中類風濕關節炎中ANA陽性率最低，為20% ～40%[2]。因而，檢測ANA對于不同類型風濕病意義重大[3]。目前，ANA檢測已成為臨床上的一個極重要的自身免疫病的篩查實驗。

2.2 類風濕關節炎相關免疫標志物 用于診斷類風濕關節炎，除了傳統的類風濕因子外，最近幾年，又出現了抗環瓜氨酸肽抗體(CCP)、抗核周因子(APF)、抗角蛋白抗體(AKA)、抗RA33抗體、抗突變型瓜氨酸波形蛋白抗體(MCV)等更敏感、更特異的診斷指標。

2.3 系統性紅斑狼瘡相關免疫標志物 抗雙鏈DNA抗體、抗單鏈DNA抗體、抗Sm抗體、抗組蛋白抗體、抗核小體抗體對于SLE的診斷和鑒別診斷也起到了非常重要的作用，特別是抗核糖體P蛋白抗體對于狼瘡腦病診斷有非常高的特異性。

2.4 干燥綜合征(Sj?gren’s syndrome，SS)相關免疫標志物 SS是常見的自身免疫紊亂疾病，它的特征是淚腺和唾液腺的淋巴細胞浸潤，導致角膜結膜炎和口腔干燥。盡管對SS的分類、癥狀、眼睛和口的干燥程度已有較完善的診斷標準，但結果并不理想。另外，對眼淚和唾液的測定缺乏靈敏度和特異性，即使是口腔唾液腺的活組織檢查，靈敏度也只有80%。而抗α-胞襯蛋白(α-fodrin)多肽抗體是從人類SS模型NFS/sld小鼠唇腺中提取的涎腺特異性自身抗體，是一種與細胞架構有關的細胞內蛋白，被認定為SS的敏感的和特異的標記物[4]。

2.5 其他自身抗體 皮肌炎、多肌炎和包涵體肌炎都是原發性、未知病因學的炎癥疾病，具有肌無力和近端肌肉組織萎縮的特征。而抗JO-1抗體、抗PMScl-100抗體、抗PL-7抗體、抗PL-12抗體、抗Mi-2抗體、抗Ku(p78/80)抗體、抗SRP抗體等這些肌炎特異性自身抗體和肌炎相關性自身抗體的檢測，對于肌炎的診斷和鑒別診斷起到了畫龍點睛的作用。

因此，讓學生全面了解各種疾病的特異性和相關性自身抗體是非常必要的。

3 要讓學生對常見自身抗體的檢測方法有所了解

因為是臨床實驗的實習，所以各種實驗的檢測原理和檢測方法是學生們要重點掌握的內容。從上面的內容可以看出，風濕免疫性疾病種類很多，用于風濕免疫性疾病的診斷和鑒別診斷的自身抗體也有很多。從我們科風濕免疫實驗室現在已經開展的項目來看，檢測方法歸納起來主要有以下四種。

3.1 間接免疫熒光法(Indirect Immunofluorescence，IIF) 用特異性抗體與標本中相應抗原反應，再用熒光素標記的第二抗體(抗抗體)與抗原抗體復合物中第一抗體結合，洗滌后在熒光顯微鏡下觀察特異性熒光，以檢測未知抗原或抗體。本實驗室主要用于 ANA、APF、AKA和抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)的檢測。其優點是形象、直觀，一目了然地觀察結果，但缺點是只能定性，或者半定量，而且結果容易受觀察者主觀因素的影響。

3.2 酶聯免疫吸附試驗法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)[5]其基本原理是把抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性;并將抗原或抗體與某種酶連接成酶標記抗原或抗體，它既保留了免疫活性，又保留了酶的活性;測定時將受檢樣品(含待檢抗原或抗體)和酶標記抗原或抗體按一定程序與結合在固相載體上的抗原或抗體反應形成抗原抗體復合物;用洗滌的方法將固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例;加入底物后，底物被固相載體上的酶催化變成有色產物，通過定性或定量檢測有色產物量即可確定樣品中待測物質含量。由于酶催化效率很高，故可極大地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的靈敏度。本實驗室開展的類風濕因子分型(RF-IgA/G/M)、抗環瓜氨酸肽抗體(CCP)、抗RA33抗體、抗dsDNA抗體、抗核小體抗體、抗線粒體抗體M2型、抗α-胞襯蛋白多肽抗體都是采用的ELISA法，而且都是定量檢測。

3.3 免疫印跡法(Immunoblot Test，IBT) 是在蛋白質電泳分離和抗原抗體檢測的基礎上發展起來的一項檢測蛋白質的技術，將SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的高分辨力與抗原抗體反應的高特異性相結合。臨床上抗核提取物抗體(ENA)的測定最常使用的方法就是IBT。

3.4 速率散射比濁法(Rate Nephelometry) 是抗原抗體結合反應的動力學測定法。所謂速率是指抗原抗體反應在單位時間內形成免疫復合物的量，連續測定各單位時間內復合物形成的速率與其產生的散射光信號聯系在一起，形成動態的速率散射比濁法，每項檢測僅1～2分鐘即可完成。本實驗室開展的免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM、IgE、IgG4)、補體(C3、C4)、抗鏈球菌溶血素O、抗鏈球菌DNA酶、C-反應蛋白、類風濕因子的測定均使用西門子的BNP特種蛋白儀，采用速率散射比濁法全自動定量檢測。操作簡單，只需要將標本放入樣品盤，在電腦上發出指令就行，并且能很快得到結果，能為臨床提供及時、準確的報告。

4 要讓學生熟悉實驗的全程操作，讓每位學生都親自動手參與實驗的每一個步驟與環節

學生對于實驗的全過程有了深刻的了解，這樣在今后的獨立工作中，就可以把握好每一個實驗環節，養成縝密的思維習慣，為他們以后完成自己的工作打好基礎。在實驗之前，要讓學生明白一個基本思路，那就是免疫學檢測技術的基礎是抗原抗體反應。在實驗過程中，要充分發揮學生的積極性和技巧性。每個人要獨立完成實驗，其目的是訓練正確、熟練的操作能力，養成良好的工作習慣，遵守實驗操作規程，認真觀察實驗結果，切忌走馬觀花。實驗完成后，要認真總結實驗過程中出現的問題，解答每一位學生提出的疑問，讓每位學生都弄懂弄通免疫指標在臨床診斷的重要意義，為以后工作中合理、正確地解答病人和臨床醫生的疑問打下良好的基礎。

總之，通過風濕免疫臨床實驗的相關學習，讓學生對風濕免疫性疾病的范疇和分類有更全面的了解，特別是對自身免疫性疾病常見的自身抗體及其檢測方法和操作過程會有更直觀、更直接、更感性的認識。不管學生以后是從事臨床工作，還是從事實驗室工作，相信這對他們以后的工作會有很大的幫助。

1 陸再英，鐘南山.內科學[M].第7版.北京:人民衛生出版社，2008:842-845.

2 Fritsch C，Hoebeke J，Dali H et al．52-kDa Ro/SSA epitopes preferentially recognized by antibodies from mothers of children with neonatal lupus and congenital heart block[J].Arthritis Res Ther，2005;8(4):101-107.

3 Metskula K，Salur L，Mandel M et al．Demonstration of high prevalence of SS-A antibodies in a general population:association with HLA-DR and enterovirus antibodies[J].Immunol Lett，2006;10(6):14-18.

4 Turkcapar N，Olmez U，Tutkak H et al．The importance of alpha-Fodrin antibodies in the diagnosis of Sj?gren’s syndrome[J].Rheumatol，2006;26(4):354-359.

5 王蘭蘭，吳健民.臨床免疫學與檢驗[M].第4版.北京:人民衛生出版社，2008:103-104.